提高保乳手術冷凍切片質量的技術探討

董蕓蓉

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈逐年上升趨勢，治療主要采用外科手術的方式。早期乳腺癌實施保乳手術可有效減少患者的痛苦，提高生活質量，減少手術并發癥，且能獲得與改良根治術相同的長期生存率，故保乳手術日益得到臨床與廣大患者的青睞。術中快速冷凍病理診斷在保乳手術中對確定腫塊的性質，明確切緣的狀況及前哨淋巴結有無轉移起著至關重要的作用，繼而為臨床醫師決定手術方案提供可靠的依據。本文通過回顧性分析，探討如何提高保乳手術冷凍切片的質量?，F報道如下。

1　資料與方法

1.1材料 選取2017年1－6月寧波市臨床病理診斷中心術中送檢保乳手術標本（包括前哨淋巴結、腫塊、切緣）80例，對其進行回顧性研究總結。

1.2儀器及試劑 ThermoCryotomeFSE冷凍切片機，Leica819刀片，包埋劑（普通膠水），固定液（甲醇），梯度乙醇，二甲苯，Baso蘇木精染液，Baso醇溶性伊紅染液，均購置珠海貝索生物技術有限公司。

1.3方法 切片機速凍臺溫度設置在－40℃左右，箱體及凍頭溫度設置在－15℃左右，具體根據組織類型不同作適當調節。送檢組織規范取材后，用吸水紙將組織表面的血性液體吸干，在預冷的標本托上涂少量包埋劑，待包埋劑底部變白即放入組織，加蓋少量包埋劑，輕輕壓上速凍錘，待組織能與速凍錘分開后即可進行切片。將標本托固定在切片機的凍頭上，先利用冷凍箱左側的快進退鍵按鈕使組織塊恰好位于切片刀的后方，先進行粗修，暴露至組織最大面，即可進行細修切片。良好的切片便在防卷板下方形成一張完整平坦且無皺褶的薄片，若切片略有彎曲可用小毛筆輕輕展平切片，打開放卷板，用載玻片平穩地輕壓組織，使其平整地吸附到載玻片上[1]，貼片完成后立即入固定液中固定1 m in，行常規HE染色。

2　結果

切片完整，厚薄均勻，無皺褶及裂痕，組織結構清晰，無冰晶形成，染色鮮艷，核質分明，脫水透明潔凈，封裱美觀（圖1～ 2）。

3　討論

冷凍切片是指新鮮組織不經任何固定脫水等處理，直接在低溫恒冷切片機冷凍后馬上進行切片的一種技術[2]，其目的是在短時間內作出準確的病理診斷，而切片質量的保證，除組織規范取材外，與組織的速凍包埋、切片的溫度、切片的技巧及染色等因素是密不可分的。

3.1取材 送檢標本必須新鮮無固定，取材時應務必保持取材臺面及取材器械的干燥，嚴禁用流水沖洗標本，如遇水時，用干紗布或吸水紙將組織吸干，以免產生冰晶。（1）前哨淋巴結：淋巴結最大徑＞0.5 cm，則應剖開取材，同時應盡量將其周圍無診斷意義的脂肪組織剔除干凈，因脂肪組織的冷凍溫度低于淋巴結組織，兩者的冷凍時間不一致，當淋巴結組織凍好時，脂肪組織還未凍上，導致切片時被膜不完整。（2）腫塊：取材大小應以 1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm 為佳，平整，厚薄均勻，病變不夠典型時可適當增加取材，夾雜在腫塊中間的脂肪組織無法剔除，腫塊周圍的脂肪組織也應盡量剔除干凈。（3）切緣：應根據臨床醫師標記進行取材，為防止標本差錯，用不同顏色的標本托區分各方向切緣。

3.2速凍及包埋 速凍是影響冷凍切片質量最關鍵的因素，組織若不是在最短時間內冷凍，就易產生冰晶。冰晶就是緩慢冷凍使細胞內的水分子向細胞間疏松區域游離、聚集，然后凝結成冰。冰晶會把組織或細胞間隙擴大，等片子快速放入固定液后，冰融化成水，周圍組織收縮，引起組織結構變形并留下了大量空洞。因此，只有快速冷凍，才能在細胞內水分子還沒有游離出細胞前即凝結成冰，使胞漿內的有形物質基本上保持在原位[3]。標本托上的包埋劑應盡量少放，包埋劑太多會影響冷凍的速度，繼而產生冰晶。淋巴結及切緣組織過小或過薄時，可將包埋劑先滴加在標本托上，制作一個冰托，再將組織放在上面進行包埋。對于含脂肪組織較多的切緣組織，由于脂肪組織本身結構的特殊性，其被疏松結締組織分割成脂肪小葉，脂肪小葉由大量群集的脂肪細胞構成，脂肪細胞中含有大量脂滴，很難被凍硬，可將它們放在吸水紙間，用手指輕壓，把脂滴擠出后再進行包埋。

圖1　乳腺癌，組織結構清晰，核質分明，染色鮮艷（HE，×100）

圖2　前哨淋巴結，組織結構清晰，核質分明，染色鮮艷（HE，×100）

3.3切片 腫塊切片時手搖輪用力應均勻、柔和，盡量切取靠近凍錘表面的組織，切出最大面即可，因為修得越深，里面的組織凍得越慢，易產生冰晶。淋巴結組織由于其細胞較豐富，纖維成分少，組織易發脆，切片時容易產生裂痕，切片溫度應調節至－12℃左右，切片厚度4 m，若出現裂痕，可用拇指指腹輕按標本使其復溫，淋巴結的被膜一定要切全，以免被膜下竇內的微小轉移癌漏診。對于含較多脂肪組織的切緣，將箱體溫度調節至－35℃左右，切片厚度15～20 m，切片時應快速進刀，因為刀口的溫度低于冷凍組織的溫度，若勻速緩慢進刀，會使切片上的脂肪組織變軟，使得切片粘連于刀口或自身粘連，不能平整展開而出現皺褶[4]。需指出的是切片時，觀察窗不可打開過大，其一防止溫度升高影響切片；其二防止散熱片及速凍臺產生更多的冰霜，影響冷凍系統的效率。

3.4固定 固定可有效抑制組織內各種酶的活性，防止組織自溶和腐敗，保持組織與生活時相似的結構和形態[5]。貼片完成后應立即放入固定液中固定1 min，固定若不及時充分，會造成細胞核模糊不清，嚴重影響診斷質量。固定液選擇甲醇，其固定時間快，細胞收縮小，對細胞核和抗原的保存較好[6]。

3.5染色及封片 入Baso蘇木精染液染色2 m in，水洗，溫水藍化，入Baso醇溶性伊紅染液染色2～3 s，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。若使用堿性液體藍化，水洗應充分，否則會造成伊紅著色不均，同時二甲苯透明也應充分，防止切片呈云霧狀。

綜上所述，保乳手術中需要做冷凍切片的標本量大，時間緊，需要對標本進行科學的統籌管理，對各個環節進行質量控制，才能在最短的時間內完成標本的切片及染色，確保病理診斷的準確與及時，為手術保駕護航。