應(yīng)用MSP檢測子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

嚴(yán)力鋒，汪期明

子宮內(nèi)膜異位癥最常異位于卵巢，是最常見的婦科良性疾病之一；但表現(xiàn)出多種惡性行為，并可發(fā)生惡變。卵巢子宮內(nèi)膜異位癥惡變的主要細(xì)胞學(xué)類型是子宮內(nèi)膜樣腺癌和卵巢透明細(xì)胞癌，稱為子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌（EAOC）。RASSF2A基因是抑癌基因的一種，該基因的失活同胃癌、肺癌、鼻咽癌及卵巢癌等腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1-4]。

MSP法檢測甲基化的原理是根據(jù)甲基化和非甲基化等位基因修飾后的序列不同，設(shè)計(jì)兩對分別針對甲基化和非甲基化狀態(tài)的引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的不同，反映特定區(qū)域的甲基化狀態(tài)。本研究通過MSP法分析RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與EAOC的研究作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集2015年5月至2016年5月寧波市婦女兒童醫(yī)院因卵巢癌行手術(shù)治療患者的石蠟包埋標(biāo)本。患者年齡22～69歲，平均40歲。病例組：30例卵巢透明細(xì)胞癌（OCC）患者的組織，30例卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌（OEA）患者的組織。對照組：正常子宮內(nèi)膜組織。剔除標(biāo)準(zhǔn)包括：原發(fā)性癌，新輔助化療患者，缺乏石蠟標(biāo)本。所有病例在手術(shù)前6個(gè)月內(nèi)沒有接受GnRH-a或者性激素治療或使用抗生素。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本采集方法 收集各病理組織后進(jìn)行常規(guī)處理，切下后放置到冰盒當(dāng)中，冰箱保存，提取DNA完成甲基化研究。

1.2.2DNA提取方法 使用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司TIANGEN DP215）提取DNA：（1）將重量組織處理為勻漿，轉(zhuǎn)移至EP管中，10000 r/m in，離心1 min。離心結(jié)束后，加入緩沖液GB（200l）、蛋白酶K溶液（20l），顛倒搖勻，56℃放置水浴，隔半個(gè)小時(shí)顛倒搖勻1次，孵育3～4 h，直至組織完全消化。（2）將上述EP管取出，加入－20℃的無水乙醇（200l），顛倒搖勻，可見EP管中少許絮狀物。（3）將EP管中液體置入吸附柱CB3，放入收集管，離心30 s，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 000 r/m in，離心結(jié)束后，取出收集管，棄管中廢液，吸附柱CB3置入收集管。（4）將緩沖液GD（500l）放入吸附柱CB3，設(shè)置轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，離心30 s，離心結(jié)束后，棄廢液，吸附柱CB3放入收集管。（5）漂洗液PW（700l）置入吸附柱CB3，開始離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，時(shí)間30 s，離心結(jié)束后，棄廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。（6）漂洗液PW（500l）置入吸附柱CB3，開始離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速12 000 r/m in，時(shí)間30 s，離心結(jié)束后，棄廢液。（7）繼續(xù)離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速12000 r/m in，時(shí)間 2m in，離心結(jié)束后，棄廢液。（8）為清凈參與漂洗液，在室溫下將吸附柱CB3靜置4～6 min，使漂洗液自然風(fēng)干（因漂洗液中添加過乙醇，而乙醇會影響后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果，所以需室溫下靜置，風(fēng)干殘留乙醇及漂洗液）。（9）吸附柱CB3換1.5m lEP管，置入洗脫緩沖液TB（150～200l），室溫下靜置 4 ～ 5 min（此步需剪去吸附柱的蓋子，EP管上寫兩個(gè)編號；且置入洗脫緩沖液TB時(shí)，需懸空滴入，吸附膜中間處最佳）。（10）繼續(xù)離心，設(shè)置轉(zhuǎn)速12000 r/min，時(shí)間2min，離心結(jié)束后，離心管中液體即為溶解的DNA。（11）將DNA溶液保存在―20℃冰箱中備用。

1.2.3DNA的SssI修飾和純化 （1）稀釋S-腺苷甲硫氨酸（SAM）：取1l的32 mmol/L濃度的SAM，加入19l去離子水，使終濃度為160mol/L。（2）依次加入以下組分：10×NEBBuffer2l，SAM（160mol/L）2l，DNA 1g，M.ssI(4 U/l)1l，去離子水15l，總體積20l。（3）輕輕混勻，37℃孵育 1 h，65 ℃熱失活20 m in終止反應(yīng)。

1.2.6修飾后DNA純化回收 （1）按照Promega Wizard Cleanup DNA純化回收說明，70℃水浴預(yù)熱雙蒸水；配置80%異丙醇。（2）加1m lPromega’s Wizard DNA Clean-up resin，輕柔顛倒混勻，使DNA充分與樹脂結(jié)合。（3）將混合物移入注射器針筒，緩慢移動(dòng)針?biāo)ǎ懦鲆后w，小柱內(nèi)有回收的白色樹脂。（4）將80%的異丙醇2m l移入針筒內(nèi)（針筒與回收小柱相連）。緩慢移動(dòng)針?biāo)ㄅ懦鲆后w，洗脫小柱內(nèi)已回收的白色樹脂。（5）將回收小柱放入新管內(nèi)，12 000 r/min離心2 m in，去除殘余液體，甩干樹脂。（6）加入70℃水浴預(yù)熱的雙蒸水50l，5m in后，12000 r/m in離心 20 s。（7）移液器加3M NaOH 5.5l，作用15m in，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7甲基化特異性PCR （1）引物序列：甲基化特異 性 引 物 MSP-forward 5’-GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG-3’和 MSP-reverse 5’-AAAAACCAACGACCCCCGCG-3’，非甲基特異性引物為USP- forward，USP- forward 5’-AGTTTGTTGTTGTTTTTTAGGTGG-3’和 USP-reverse 5’-AAAAAACCAACAACCCCCACA-3’，擴(kuò)增片段均為 108 bp。（2）應(yīng)體體系：10×PCR Buffer 2l，dNTPmix(2.5 mmol/L dNTP)1.6l，上游引物（10mol/L）0.4l，下游引物（10mol/L）0.4l，修飾后的DNA 2l，熱啟動(dòng)酶＆DNA聚合酶0.1l，去離子水13.5l，總體積 20l。（3）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，甲基化特異性引物58℃退火30 s，非甲基化特異性引物54℃30 s，然后72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min反應(yīng)完成。（4）2%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。（5）甲基化判斷標(biāo)準(zhǔn)：同一標(biāo)本，如果非甲基化引物和甲基化引物均有產(chǎn)物擴(kuò)出，或僅甲基化引物有產(chǎn)物擴(kuò)出，判斷為甲基化；如果僅有非甲基化引物有產(chǎn)物擴(kuò)出，而無甲基化引物產(chǎn)物擴(kuò)出，判斷為非甲基化。

1.3統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

本研究采用針對RASSF2A啟動(dòng)子MSP特異性引物對啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢透明細(xì)胞癌組織RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化陽性率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（2=27.8，＜0.05），卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌組織RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化陽性率明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織（2=34.7＜0.05），見表1。部分組織的MSP結(jié)果見封二彩圖4。

3　討論

子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生率在育齡期女性是7%～15%，絕經(jīng)后女性少于2%[5]。雖然子宮內(nèi)膜異位癥是一種良性疾病，但表現(xiàn)出多種惡性行為，包括局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，與鄰近組織粘連，然后侵襲和破壞。目前子宮內(nèi)膜樣腺癌和透明細(xì)胞癌是EAOC主要的組織病理學(xué)亞型[6]，而且其他惡性腫瘤的病理組織學(xué)亞型也與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)，已知的有交界性漿液性癌或漿液性癌，但發(fā)生率很少[7]。

子宮內(nèi)膜異位癥惡性轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤的過程中存在許多基因?qū)W事件，如染色體雜合性缺失（LOH）和基因突變等，如LINE-1、ARID1A和BAF250a、PIK3CA等的突變[8-10]。近些年隨著對腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制研究的不斷深入，表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生中的作用逐漸受到人們的重視。它的主要表現(xiàn)形式有：DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記、母體效應(yīng)及RNA編輯等。DNA甲基化是重要的表觀遺傳學(xué)修飾形式，研究表明抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活的一個(gè)重要機(jī)制[11]。

表1　不同組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化率的比較

RAS蛋白通過一些重要的信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖及凋亡等生命活動(dòng)。研究表明：RAS信號通路的改變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，近年來一組含有RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域的蛋白被命名為RASSF家族，是 RAS激活信號傳導(dǎo)通路中非常重要的負(fù)效應(yīng)調(diào)節(jié)子。迄今為止，共發(fā)現(xiàn)10種RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族成員，其中有9種在人類腫瘤中低表達(dá)或缺失[12]。RASSF2A基因作為一個(gè)潛在的抑癌基因，其表達(dá)減弱或缺失已見于結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、梅克爾細(xì)胞癌及尤文氏肉瘤等腫瘤。但目前有關(guān) RASSF2A基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與子宮內(nèi)膜異位惡變關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)采用 MSP方法測定各個(gè)組織的 RASSF2A啟動(dòng)子甲基化情況，MSP法檢測甲基化的原理是根據(jù)甲基化和非甲基化等位基因修飾后的序列不同，設(shè)計(jì)兩對分布針對甲基化和非甲基化狀態(tài)的引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的不同，反映特定區(qū)域的甲基化狀態(tài)。MSP法特異性高、簡單易行、費(fèi)用和耗時(shí)小。在本研究中，30例卵巢透明細(xì)胞癌和30例卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌，分別有63.33%和73.33%的患者發(fā)生RASSF2A啟動(dòng)子甲基化，而正常的子宮內(nèi)膜組織中沒有發(fā)生甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜ 0.05）。

DNA甲基化是復(fù)制 DNA之后重要的調(diào)節(jié)方式，與胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化相關(guān)。有研究認(rèn)為基因啟動(dòng)子的甲基化在抑癌基因失活過程中的影響很大，RASSF2A失活的主要途徑是啟動(dòng)子區(qū)的甲基化[13-14]。RASSF2A甲基化之后喪失負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用，導(dǎo)致細(xì)胞容易出現(xiàn)惡變。有文獻(xiàn)報(bào)道，在結(jié)腸癌細(xì)胞系中存在70%～89%的RASSF2A啟動(dòng)子甲基化，結(jié)腸癌中有42.0%～72.6%的RASSF2A啟動(dòng)子甲基化[15-16]。

綜上所述，RASSF2A啟動(dòng)子甲基化跟EAOC的發(fā)生相關(guān)。隨著對該領(lǐng)域研究的深入尤其是抑癌作用的明確，RASSF2A啟動(dòng)子甲基化可以作為早期診斷EAOC的重要生物學(xué)方法。

參考文獻(xiàn)：