糖尿病腎病患者線粒體結構變化對腎小管病理損傷的影響分析

詹明，張國陽，楊軍，余晶波

糖尿病腎病（DN）是引起終末期腎臟病（ESRD）的主要原因，大致占ESRD患者的40%～50%[1]。由于DN發病原因復雜，發病機制尚不完全清楚，臨床治療措施有限，故其發病機制的研究一直是國內外腎臟病領域研究的重點。近年來研究發現，DN腎小管病變并不繼發于腎小球，而是其早期和原始特征改變。相當部分糖尿病患者存在腎小管和間質細胞的病理萎縮，而腎小球正常[2]。因此，腎小管細胞損傷是DN發病過程中的一個核心環節。

最新的研究表明，線粒體不僅是細胞內能量工廠，也是高度動態的細胞器，處于不斷的融合和分裂中[3]。在糖尿病高糖狀態下，在細胞和動物研究中表明腎小管細胞中的線粒體發生一系列形態和超微結構的病理變化，這些變化與腎小管細胞線粒體自噬和氧化應激反應等密切相關，在細胞氧化損傷與細胞凋亡等過程中起著重要作用[4]。然而，有關腎臟細胞線粒體結構變化在臨床上對DN患者發病過程中起的作用，尤其是對腎小管損傷的影響和相關性研究，文獻報道十分有限。因此，本研究針對DN患者，在臨床上觀察線粒體結構變化和對腎小管病理改變的影響和作用，以進一步揭示DN的發病機制。現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集寧波市第一醫院腎臟病理標本庫中篩選2014年1月至2016年12月的DN患者并行腎活檢確診的病例共20例（DN組），同時收集微小病變患者并行腎活檢確診的病例共20例作為對照組。

1.2實驗方法 收集兩組腎活檢組織標本行進一步病理檢查，通過常規組化染色以觀察腎臟病理改變，并比較兩組腎臟損傷等級評分。通過透射電鏡觀察和比較腎小管細胞中線粒體的形態和超微結構，進一步分析DN組腎小管細胞中線粒體結構變化和腎小管損傷的相關性。

將腎活檢組織以4%多聚甲醛固定，經乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟組織切片及HE、PAS等常規組化染色后，在光鏡下行石蠟切片檢查。用于電鏡的組織標本以2.5%戊二醛固定，經脫水、包埋、超薄切片及染色等制備電鏡標本供透射電鏡檢查。腎臟損傷等級評分采用0～3分的腎臟形態損傷評分系統：沒有腎小球/腎小管損傷為0分；25%的腎小球/腎小管損傷為1分；25%～50%的腎小球/腎小管受累為2分；50%及以上的腎小球/腎小管面積受累為3分。

腎活檢組織中腎小管細胞線粒體超微結構觀察方法采用固定后的腎組織塊常規樣品制備，超薄切片鉛鈾雙染，透射電鏡下觀察。選取含線粒體豐富的腎小管上皮細胞，主要觀察線粒體融合/分裂的結構變化，線粒體肌絲、肌原纖維、體積和嵴密度及線粒體嵴的超微形態結構變化，并統計發生上述線粒體結構變化的腎小管細胞百分比。

1.3統計方法 采用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，采用 檢驗；采用Pearson分析進行相關性分析。＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組腎臟損傷比較 兩組腎小球和腎小管的損傷評分差異均有統計學意義（均＜ 0.05）。見表 1。

2.2腎小管細胞線粒體超微結構觀察 對照組微小病變患者腎小管的線粒體呈正常的圓柱狀形態，線粒體外膜和內膜結構清晰，嵴分布均勻。其中含正常結構線粒體的腎小管細胞占（80±5）%。而DN組的腎小管細胞中線粒體較對照組出現片段化改變，其中（60±12）%的腎小管細胞出現線粒體的超微結構異常變化，表現為線粒體片段化和圓柱狀結構斷裂，呈小橢圓形散在分布，質量和體積減少，線粒體基質破壞且出現線粒體嵴溶解和嵴重構。

2.3線粒體結構改變和腎小管病理損傷的相關性分析 進一步將DN組腎組織樣本中發生線粒體超微結構變化的腎小管細胞百分比和腎小管病理損傷評分這兩個重要參數進行相關性分析，結果顯示發生線粒體結構變化的細胞百分比與腎小管損傷評分呈正相關（=0.816＜ 0.05）。

3　討論

傳統觀點認為DN主要是腎小球病變，而腎小管的病變較輕微且非特異性。近期的研究發現，腎小管病變也是DN的特征性病理改變，并非繼發于腎小球，且是預測疾病進展和預后的重要指標。臨床觀察證明，51%的I型糖尿病患者存在腎小管細胞萎縮[5]。國內外學者統計發現：在DN的病理改變中，大約1/3的患者無腎小球病變，表現為明顯的腎小管細胞和腎間質損害；1/3的患者為腎小球病變；其它1/3的患者則無腎臟結構變化[6-7]。因此，腎小管損傷的研究是闡明DN發病機制的重要研究方向。本研究證實了DN患者的腎組織中腎小球和腎小管均出現了特征性的病理損傷，且損傷評分與對照組微小病變患者比較差異顯著，提示腎小管損傷在DN發生發展中的關鍵作用。

目前，糖尿病患者發生腎小管病理損傷的病因和機制仍不清楚。腎小管上皮細胞在腎臟的重吸收和調節尿液過程中起著關鍵作用，需消耗大量的ATP酶，為此腎小管富含大量亞細胞器即線粒體以不斷供給能量。因而，從線粒體著手是研究腎小管損傷機制的重要途徑[8-9]。本研究進一步通過電鏡觀察發現DN患者的腎小管細胞線粒體發生了顯著性結構變化，包括出現線粒體斷裂和片段化，線粒體質量和體積減少，線粒體嵴腫脹并伴有嵴溶解等特征性的超微結構變化。且定量分析顯示DN組中含異常結構線粒體的腎小管細胞數量是對照組的3倍。此外，本研究的相關性分析顯示含異常結構線粒體的腎小管細胞百分比與腎小管損傷評分呈正相關，提示糖尿病環境下線粒體超微結構變化是 DN腎小管病變的一個重要致病因素。結果分析其主要致病原因在于，線粒體的結構決定功能，在糖尿病高糖作用下，腎小管中的線粒體動力學結構發生異常，引起線粒體氧化磷酸化功能障礙，釋放過量的活性氧簇，并激活了線粒體凋亡途徑，從而引起腎小管細胞氧化損傷和凋亡。因此，在病理上表現為腎小管的萎縮等病變。

表1　兩組腎臟損傷評分比較 分

本研究揭示了腎小管細胞線粒體結構變化在DN發病過程中的關鍵作用，為糖尿病腎小管損傷的發病機制提供了新的臨床和實驗依據。這一問題的闡明對DN的發病機制和靶向治療的研究具有重要的臨床意義，將為今后開發以線粒體為靶向藥物干預治療來防治DN開辟新的理論和分子“靶點”，為最終有效治療DN這一日益增長且嚴重危害人們健康的疾病提供新的思路和策略。