雙靶向配體化力達霉素DTLL的制備優化和穩定性研究

葉程，曹睿，宋文憑，李良，李毅，趙春燕，李亮，邵榮光

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雙靶向配體化力達霉素DTLL的制備優化和穩定性研究

葉程，曹睿，宋文憑，李良，李毅，趙春燕，李亮，邵榮光

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所腫瘤室/衛生部抗生素生物工程重點實驗室

通過對具有高效抗腫瘤活性的類抗體偶聯藥物—??雙靶向配體化力達霉素（DTLL）制備過程的優化，獲得純度高和活性強的 DTLL 產品；探討影響 DTLL 穩定性的主要因素，為臨床申報和工業化生產提供依據。

分別對 DTLL 前體（DTLP）蛋白表達載體、宿主菌株、表達溫度、誘導劑終濃度、菌體密度和誘導時間進行優化。以高壓破碎法提取可溶性目的蛋白，采用 Ni+親和與分子篩層析兩步純化，得到高純度 DTLP，再與力達霉素發色團組裝獲得 DTLL。采用 HPLC、MTS、ELISA 法進行穩定性試驗，分別監測 DTLL 凍干樣品的蛋白純度、發色團含量、細胞毒和親和力活性的變化。

經過發酵提取工藝優化，每升發酵液所得 DTLP 蛋白約為 22 mg，是優化前每升9 mg 的 2.4 倍，其蛋白純度達到 99.7%；DTLL 組裝效率達到 68%；穩定性試驗結果顯示，DTLL 凍干樣品對光照敏感，在–80 ℃低溫避光環境下可穩定保存。

成功優化了雙靶向配體化力達霉素 DTLL 的制備工藝，提升了產品純度和產率，為其后續生產和臨床申報提供了實驗基礎，也為其他抗體偶聯藥物的制備提供了較成熟完善的技術平臺。

重組融合蛋白質類； 蛋白質穩定性； 制備工藝； 配體化力達霉素

人類表皮生長因子受體（EGFR）家族參與激活細胞的增殖、分化和遷移等通路[1]。EGFR 和 HER2 是該家族中的重要成員，在腫瘤細胞過表達持續異常激活，可導致腫瘤的發生和發展。兩者在多種腫瘤細胞中共表達，因此針對 EGFR 家族的靶向藥物具有良好市場前景[2-3]。如抗體偶聯藥物（ADC）Kadcyla?作為 HER2 陽性乳腺癌的二線用藥，治療效果已得到廣泛認可[4]。因此，ADC 或免疫融合蛋白等靶向藥物的制備工藝研究同樣備受關注。通過基因重組技術制備免疫融合蛋白的方法簡單可行，可獲得均一性抗體藥物[5]。

力達霉素（lidamycin，LDM）是由放線菌 Streptomyces globisiporus C-1027 提取的烯二炔類抗腫瘤抗生素，對腫瘤細胞具有強烈殺傷活性[6-7]。雙靶向配體化力達霉素（DTLL）是在 LDM 輔基蛋白結構基礎上，通過生物工程技術改造得到的雙特異性靶向 EGFR 和 HER2 的配體化力達霉素。體內外實驗證明，DTLL 對宮頸癌、食管癌和胰腺癌等多種腫瘤均有效[8-10]。

DTLL 擁有良好的臨床應用前景，而其制備工藝和指控標準尚不完善，基于實驗室的制備產率和純度尚不能達到工業生產和臨床試驗申報的要求，也缺乏質量控制標準及產品穩定性評價等重要指標。因此，針對其生產制備和儲藏過程中關鍵環節進行優化，獲得符合臨床申報要求的制備工藝、質量控制標準和儲藏條件顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高糖型 DMEM 培養液購自美國 Corning 公司；胎牛血清 FBS 購自美國 Gibco 公司；PMSF、咪唑、十二烷基磺酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇、卡那霉素購自美國 Amresco 公司；HisTrap 預裝柱和 Healthcare SuperdexTM75 10/300 GL 分子篩色譜柱購自美國 GE 公司；超濾離心管、PVDF 膜和 0.22 μm 濾器購自美國 Millipore 公司；anti-His-tag 小鼠一抗、HRP 標記羊抗小鼠 IgG 購自美國 CST 公司；內毒素去除試劑盒、內毒素含量檢測試劑盒購自南京金斯瑞生物科技有限公司；MTS 試劑購自美國 Promega 公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 菌株 DTLP 表達菌 pET-Ec-LDP-Hr（原始菌株）由本實驗室構建并保存（菌種保藏號：CGMCC No. 2846）；BL21starTM（DE3）感受態細胞購自美國 Novagen 公司；BL21（DE3）、BL21（DE3）pLySs 感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 細胞株 人胰腺癌 Mia-paca-2 細胞購自美國模式培養物集存庫（ATCC），培養于含 10% FBS、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的高糖型 DMEM 培養液中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.2 方法

1.2.1 高表達菌株篩選 將表達載體 pET-Ec-LDP-Hr 分別轉化至 BL21starTM（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLySs 感受態細胞中。挑取單克隆接種至 4 ml LB 培養基（含有卡那霉素 50 μg/ml）中，37 ℃搖床培養至600= 0.5 時，以終濃度為 0.1 mmol/L IPTG 誘導 6 h。收集 1 ml 菌液中菌體進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.2 發酵條件篩選 表達菌株在不同 IPTG 濃度（0.1 ~ 1 mmol/L）、菌體起始密度（600= 0.2 ~ 1.5）、培養溫度（28 ℃、30 ℃、37 ℃）、以及誘導時間（3 ~ 7 h）分別進行誘導培養至菌體停止生長。收集 1 ml 菌液中菌體進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3 表達產物定位分析 根據 pET 系統操作手冊中的步驟，分別制備菌體全細胞組分、培養液上清組分、周質腔組分、細胞質可溶性組分和包涵體組分進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.4 氨基酸測序驗證 恒流 250 mA 2 h 轉印蛋白至 PVDF 膜，考馬斯亮藍染色后裁切相應誘導表達蛋白條帶進行 N 端氨基酸測序。

1.2.5 Ni+親和層析純化 菌體重懸后以110 kPa 壓力破碎，4 ℃、12 000 ×離心 30 min，取上清液經 0.45 μm 濾器過濾后流經 HisTrap 預裝柱，分別以含 20、50、70 和 200 mmol/L 咪唑的洗脫液收集各組分進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.6 分子篩層析純化 Ni+純化后蛋白經 ?KTA purifier 系統經分子篩色譜柱進行精細純化。流動相為 PBS（20 mmol/L，pH 7.4），檢測器波長 280 nm。

1.2.7 蛋白純度測定 樣品蛋白 BCA 法定量至0.1 mg/ml，使用分子篩凝膠色譜柱經 HPLC 純度測定。流動相為 PBS（20 mmol/L，pH 7.4），檢測器波長 280 nm。結果經自動積分和面積歸一化法計算純度。

1.2.8 發色團含量測定 樣品蛋白定量至0.1 mg/ml，使用 C4 柱（Jupiter C4 250 mm ×4.0 mm，30 nm）經 HPLC 檢測發色團含量。流動相為水:乙腈:三氟乙酸（75%:25%:0.025%），檢測器波長 350 nm。檢測結果經自動積分，計算有效發色團峰面積。

1.2.9 發色團分離制備 取力達霉素純品，經半制備 C4 柱（Jupiter C4 150 mm × 10.0 mm，30 nm）分離活性發色團，流動相為水:乙腈:三氟乙酸（75%:25%:0.025%），檢測器波長 350 nm，收集流出液中發色團。

1.2.10 融合蛋白和發色團的組裝 按分子摩爾比力達霉素發色團:融合蛋白 = 5:1 的比例將兩者混合，4 ℃避光振搖 16 h 進行組裝。組裝完成后采用 3K 超濾管置換緩沖體系為 PBS。

1.2.11 內毒素檢測與去除 按照《中華人民共和國藥典》三部（2015 版）通則 1143 細菌內毒素檢查法中的方法 2 光度測定法進行。配體化力達霉素 DTLL 樣品除內毒素方法按照試劑盒說明書操作進行。

1.2.12 影響因素試驗 凍干樣品開口置密封容器中，分別放在 40 ℃溫度下，或下部放置氯化鈉飽和溶液（相對濕度 75%）25 ℃溫度下，或放在裝有日光燈的光照箱中照度 4500 Lx 的條件下，放置 5 d 取樣檢測活性，進行高溫、高濕和強光照射等試驗。

1.2.13 加速試驗 凍干樣品扣緊瓶口，置于干燥器中，下部放氯化鈉飽和溶液（相對濕度 75%），密閉容器置于 25 ℃的恒溫箱中，分別在第 1 個月、第3 個月末取樣。

1.2.14 長期試驗 考察凍干樣品在 4 ℃保存7 d、4 ℃保存 1 個月、–20 ℃保存 3 個月、–80 ℃保存 6 個月條件下供試品放置的穩定性。

1.2.15 細胞親和活性測定 取對數生長期的 MIA-paca-2 胰腺癌細胞接種于 96 孔板。預冷的 0.05% 戊二醛固定細胞后經 2% BSA 封閉，于37 ℃分別以一抗和辣根過氧化物酶二抗各孵育2 h，最后加入底物反應液 100 μl（TMB 顯色液）和終止液 100 μl（H2SO4，2 mol/L），用酶標儀測定450 nm 處吸光度。

1.2.16 細胞毒活性測定 取對數生長期的 MIA-paca-2 細胞接種于 96 孔板，以不同濃度DTLL 處理 48 h 后，加入 20 μl 的 MTS 反應液孵育 1 d，酶標儀測定 450 nm 處的吸光度。細胞存活率（%）=（加藥組–空白組）/（對照組–空白組）× 100%。

2 結果

2.1 DTLP 宿主菌株篩選

如圖 1A 所示，提取 DTLP 表達載體分別轉化至 BL21starTM（DE3）、BL21（DE3）、BL21（DE3）pLySs 宿主菌株后同原始菌株中表達情況進行比較。考染結果顯示，DTLP 在 BL21starTM（DE3）中表達含量較原始菌株 pET-Ec-LDP-Hr 顯著提升，因此選用BL21starTM（DE3）作為載體表達的宿主菌株。

2.2 DTLP 發酵條件確定

以誘導劑濃度、菌體密度、誘導溫度和誘導時間為條件進行篩選，結果顯示，誘導劑濃度0.1 mmol/L，菌體密度600= 0.6 時進行誘導，目的蛋白表達含量最高（圖 1B 和 C）；誘導溫度對蛋白表達無明顯影響（圖 1D）；誘導時間超過6 h 后目的蛋白含量降低（圖 1E）。綜合以上結果，篩選獲得的最佳發酵條件為：接種后 37 ℃培養至菌體600= 0.6 時，加入終濃度 0.1 mmol/L 的 IPTG 繼續培養 6 h，離心收集菌體。

圖 1 融合蛋白 DTLP 表達條件優化的 SDS-PAGE 分析（A：宿主菌株篩選；B：誘導劑濃度篩選；C：起始誘導菌體密度篩選；D：誘導溫度篩選；E：誘導時間篩選；M：蛋白分子標準品）

Figure 1 Optimization of fusion protein expression in different fermentation conditions by SDS-PAGE analysis (A: Screening of host strain; B: Screening of inducing agent concentration; C: Screening of cell density of initial inducing; D: Screening of inducing temperature; E: Screening of inducing time; M: Protein marker)

2.3 DTLP 表達定位分析

如圖 2A 所示，提取誘導前后菌體各組分后進行 SDS-PAGE 分析，結果表明轉化菌經IPTG 誘導后在分子量為 18 kD、21 kD 處均有蛋白條帶表達。其中 18 kD 蛋白主要表達在周質腔和胞質可溶性組分中，21 kD 蛋白主要表達在包涵體中。將該兩種蛋白的前五位氨基酸殘基測序結果與 DTLP 蛋白的完整氨基酸序列比對后發現，分子量在 18 kD 處的蛋白，其前五位氨基酸序列信號同信號肽酶剪切后 DTLP 成品的氨基酸序列一致；分子量在 21 kD 處蛋白前五位氨基酸序列同B信號肽氨基酸序列一致（圖 2B），提示 DTLP 目的蛋白應為周質腔和胞質可溶性組分中的 18 kD 蛋白表達產物。

2.4 DTLP 提取純化

菌體壓力破碎后上清液經 Ni+親和后按咪唑濃度梯度洗脫（圖 3A），得到的蛋白粗提取物再經過分子篩色譜柱純化分離，收集主峰流出液（圖 3B），HPLC檢測蛋白純度 99.7%（圖 3C）。本研究采用的壓力破碎法，提取包括周質腔和細胞質可溶性組分的細胞內總可溶性蛋白，每升發酵液蛋白收率約為 22 mg，是優化前（原始菌株）每升 9 mg 的 2.4 倍。

1：空載體；2：DTLP轉化菌株；3：培養基上清；4：周質腔蛋白；5：胞質可溶性蛋白；6：包涵體蛋白

Figure 2 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression localization (A) and verification of induced production by amino acid sequencing (B)

圖 3 SDS-PAGE 檢測融合蛋白 DTLP 的固定化 Ni+洗脫液（A）和分子篩層析純化（B）及蛋白純度檢測結果（C）

Figure 3 SDS-PAGE analysis of the immobilized Ni+affinity chromatography by different concentration of imidazole (A) and molecular sieve chromatography for the purification (B) and purity testing of fusion protein DTLP (C)

2.5 DTLL 的組裝制備

檢測組裝后 DTLL 發色團含量，計算組裝效率。組裝效率（%）= 等效發色團的力達霉素濃度 ÷ 力達霉素分子質量/（融合蛋白濃度 ÷ 融合蛋白分子質量）。計算得強化融合蛋白 DTLL 的組裝效率為 68.33%。

2.6 DTLL 內毒素檢測與去除

去除內毒素檢測表明，DTLL 樣品內毒素含量為（6.30 ± 0.05）EU/mg，符合藥典要求。

2.7 DTLL 的穩定性評價

按照 2015 版《中國藥典》關于原料藥穩定性試驗的要求，結合 DTLL 特性，設計了包括影響因素試驗、加速試驗、長期試驗的評價方法。考察項目具體包括：理化性質檢測（pH 值、發色團含量、蛋白純度）和生物活性檢測（細胞毒活性和細胞親和活性）。

圖 4 穩定性試驗項目對DTLL 凍干品細胞毒活性（MTS）和親和活性（ELISA）影響檢測[A：影響因素試驗（樣品于溫度40 ℃，光照4500 Lx，濕度75% 分別放置5 d）；B：加速試驗（樣品于RH 75%，25 ℃條件下分別放置1 個月和3 個月）；C：長期試驗；*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001]

Figure 4 Analysis of cytotoxic (MTS) and affinity activities (ELISA) in DTLL lyophilized samples in stability test [A: Stress test (set samples at high temperature = 40 ℃，high light = 4500 Lx，high humidity = 75%); B: Accelerated test (set samples at RH75%，25 ℃for 1 month and 3 months); C: Long-term test;*< 0.05;**< 0.01;***< 0.001]

2.7.1 影響因素試驗 結果顯示，高溫、高濕度、強光照射均對 DTLL 的活性造成不同水平的降低。其中高溫試驗組的親和活性與對照組相比有顯著降低（< 0.05）。高濕度試驗組吸濕增重 15.70%，與強光照射試驗組在細胞毒活性與對照組相比有顯著降低（< 0.05）（圖 4A）。高溫試驗組發色團含量降低至 46.20%，蛋白純度降低至 29.40%；高濕度試驗組發色團含量降低至 35.30%，蛋白純度降低至 44.60%；強光照射組的發色團含量明顯降低至 29.70%，蛋白純度略有下降至 72.20%（表 1）。

2.7.2 加速試驗 結果顯示，在實驗組條件下保存 1 個月和 3 個月以對 DTLL 的親和活性與細胞毒活性降低，與對照組相比有極顯著性差異（< 0.001）（圖 4B）。1 個月后有效發色團含量降低至 18.83%；3 個月后有效發色團含量進一步降低至 7.57%。而蛋白質純度檢測均未檢測到與標準品出峰時間一致的蛋白峰（表 1）。以上結果均顯示，DTLL 凍干品在加速試驗條件中不能保證穩定的理化性質和生物活性。

2.7.3 長期試驗 結果顯示，4 ℃保存 7 d 和1 個月樣品細胞親和活性和細胞毒活性均有顯著性降低（< 0.05）（圖 4C），其有效發色團含量均有降低（表 1）。而–20 ℃ 3 個月條件保存對樣品活性和純度有影響但未見顯著性差異。DTLL 在–80 ℃、6 個月條件下保存對樣品活性和純度基本無影響。

2.7.4 穩定性試驗 結果顯示，DTLL 凍干品對光照敏感，主要由于發色團本身的光不穩定性而導致其活性降低；蛋白純度與親和活性在低溫條件下相對較為穩定。綜合穩定性試驗結果，凍干樣品應采用棕色玻璃瓶儲藏，長期保存應存放在–80 ℃低溫冰箱，保存和運輸過程需注意低溫避光。

3 討論

本研究利用力達霉素的獨特結構特點，制備 DTLL 的工藝流程具有以下優勢或特點：①DTLP 蛋白末端含有增加可溶性蛋白表達的B 信號肽，可直接純化獲得具有活性的融合蛋白，避免了包涵體表達變性復性過程[11-14]。經定位分析和氨基酸測序發現，部分可溶性蛋白也存在于細胞質可溶性組分中。因此，我們將提取周質腔蛋白的滲透壓沖擊法改進為高壓破碎法，獲得包括周質腔在內的全部可溶性蛋白，每升發酵液獲得融合蛋白從9 mg/L 提高至 22 mg/L，明顯提升了產量。②DTLP 的制備過程簡便易得。蛋白序列中的 His-Tag 可以使用 Ni+柱親和方式進行提取得到粗體蛋白[15-16]，經檢測 Ni+親和層析純化得到的 DTLP 純度僅為 90% 左右[9]，尚不能達到生產和臨床申報標準。因此我們選用分子篩層析進一步純化，最終得到純度 99.7% 的 DTLP。③本研究中對 DTLP 與發色團 AE 的重建過程進行定量監測。在體外實驗中，抗體-藥物偶聯物（ADCs）的效價通常與樣品的平均藥物-抗體比率（DAR）呈正相關。而在一項關于美登素抗體偶聯物的藥物代謝動力學研究發現，更高 DAR 的樣品其血漿清除率也隨之增快，導致其效價降低[17]。因此組裝過程中彈頭藥物和靶向分子比率的檢測，對綜合評價藥品的生化特性、體內穩定性、功效以及耐受性具有重要的指導意義。在本實驗中，我們采用 HPLC 分離方法提取活性發色團AE，精確定量其含量；同時對組裝比例及組裝過程進行定量分析檢測，使 DTLP 與發色團 AE 得以充分組裝，使 DTLL 的組裝效率可穩定至 68% 左右。隨后我們將進一步針對 DTLL 的 DAR 與體內效價進行比較，以期獲得最佳治療效果。

表 1 穩定性試驗檢測 DTLL 有效發色團含量和蛋白質純度結果

注：/表示未檢測到對應蛋白峰。

Note: /Indicates that the corresponding protein peak was not detected.

此外，本研究尚有不可避免的局限性，有待改進或進一步深入探討，主要包括：①仍有大量未切除信號肽的蛋白以包涵體形式表達，后續制備工藝仍有提升產量的空間。例如，可提取包涵體蛋白后于胞外酶切，再通過復性獲得 DTLP；②純化過程中發現，DTLP 經 Ni+粗提取蛋白過程中還可能存在有多聚體形式（結果未顯示），多聚蛋白對細胞的親和活性更強，這可能是由于多聚體蛋白與配體結合能夠形成更穩定結構[18]。本研究中 DTLP 多聚體蛋白易形成絮狀沉淀，因此為保證產品制備的可重復性和穩定性，我們選用了性質更為穩定的單體蛋白進行后續制備。而有關多聚體的產生、穩定性及其相關生物學活性的后續研究尚待進一步探討。

本研究成功優化了雙靶向配體化力達霉素 DTLL 的制備工藝，為其后續生產和臨床申報奠定了基礎，也為其他 ADC 藥物的制備提供了較成熟完善的技術平臺。

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Studies on preparation, optimization and stability of dual targeting ligand-based lidamycin

YE Cheng, CAO Rui, SONG Wen-ping, LI Liang, LI Yi, ZHAO Chun-yan, LI Liang, SHAO Rong-guang

Author Affiliation: Department of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medcial College, Beijing 100050, China

The dual targeting ligand-based lidamycin (DTLL), a novel bispecific antibody-drug conjugation (ADC) like antineoplastic agent, will be prepared, followed by its optimization and stability investigation. Our study aim to provide a firm technological platform for preclinical research and industrialized production of DTLL in future.

The fusion protein of interest, which was the precursor of DTLL and named as DTLP, was prepared in bacterial expression system, followed by a series of optimized steps, including selection of host strain, expression temperature, induction concentration, cell density and induction time. Bacterium total soluble protein was extracted by high pressure crushing method. Specifically, to improve the protein purity of DTLP, the Ni+affinity and molecular sieve chromatography was used during purification process. Then DTLL with both DTLP and active enedyine (AE) of lidamycin chromophore was reconstituted. A series of stability tests were finally performed for the lyophilized DTLL by HPLC, MTS and ELISA assays to monitor the impact of several parameters such as high temperature, humidity and light on its specific binding and cytotoxic activities.

DTLP was obtained with the purity of 99.7% throughout the optimization of its preparation process, with a yield of 22 mg per liter of fermentation medium, which was 2.4 times from a yield of 9 mg per liter previously. DTLL was reconstituted with DTLP and AE with the reconstituted efficiency increased from 51.8% previously up to 68%. The stability tests indicated that the bioactive DTLL need to be stored at –80 ℃ and avoided light during its storage and transportation.

We successfully prepared for DTLL followed with a series of optimization and stability tests. Our studies provided for us a useful experimental basis for its industrial production and preclinical research, offering a promising technology platform for the preparation of the similar types of ADC drugs in future.

Recombinant fusion proteins; Protein stability; Preparation; Dual targeted ligand-based lidamycin

LI Liang, Email: liliang@imb.pumc.edu.cn; SHAO Rong-guang, Email: shaor@imb.pumc.edu.cn

國家科技重大專項（2014ZX09201042-002）；國家自然科學基金（81472787、81321004）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程項目協同創新團隊項目（2016-I2M-3-013）

李亮，Email：liliang@imb.pumc.edu.cn；邵榮光，Email：shaor@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.001

2018-01-22