貝伐珠單抗仿制藥生物活性測定方法的開發與應用

王靜齋，肖莉杰

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貝伐珠單抗仿制藥生物活性測定方法的開發與應用

王靜齋，肖莉杰

163316 大慶，黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院

貝伐珠單抗是一種人源化的抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）重組單克隆抗體，其人類免疫球蛋白 G（IgG）片段占 93%，其余的是鼠源結構，人源化部分可以使該藥的1/2延長和免疫原性降低[1]。VEGF 是血管生成的重要調控因子，VEGF-A/VEGFR2 信號由 PLC-γ1 通過促進其激動激酶 C 和 Raf-MEK 信號通路，最終通過 ERK1/2 促進血管內皮細胞的增殖[2]。原位雜交研究表明，多種人實體腫瘤中均存在 VEGF mRNA 的表達[3]。腫瘤新生血管的生成是腫瘤與其周圍環境中血管生長因子相互作用的結果[4]，貝伐珠單抗可以與 VEGF 特異性結合，從而阻斷其與受體結合，使血管內皮細胞生長因子受體（VEGFR）無法活化，從而發揮抗血管生成的作用。因 VEGF 能促進異常腫瘤血管內皮細胞增殖、遷移、新生和增加腫瘤血管通透性，故貝伐珠單抗結合 VEGF 后，異常腫瘤血管得到改善，腫瘤血管通透性變得正常，腫瘤部位的血管出現退化，腫瘤體積變小。同時，組織間隙的壓力下降，最終使化療藥物更多更順利地到達腫瘤部位[5]。

單克隆抗體藥物的生物活性檢測是指依據單克隆抗體的預期、潛在的作用機制和工作模式（可能不限于一種），采用相應的生物學測定方法和數據分析模式，在體外建立相應的細胞評價模型，模擬其作用機制，產生客觀的全程量效反映，并將供試品與參比品進行比較，供試品測定結果應在規定的范圍內。目前對于生物仿制藥生物活性檢測的方法主要是基于細胞檢測方法，其優點是特異性高、變異度小，但其受到一些條件的限制，該方法也存在操作過程較為復雜、實驗周期長、人為操作誤差等缺點。而基于表面等離子共振技術建立的活性檢測方法，是近幾年被廣泛應用于小分子制藥和生物制藥領域的新型檢測技術，它是一種物理光學特性的分析技術，近幾年也有很多這方面的報道[6-10]，該技術操作簡便、實驗周期短、樣品消耗量低，一般僅有微克級，除了可以獲得一般的親和力信息外，還能夠給出對闡述分子間結合機制更為寶貴的動力學信息，在分析測定核酸、蛋白質等大分子方面顯示出了巨大的應用潛力[11-12]。本實驗根據《人用重組 DNA 制品質量控制技術指導原則》和《中國藥典》三部（2015 版）的要求[13-14]，結合產品的特點，將人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）增殖抑制法及表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）技術相結合，對貝伐珠單抗生物仿制藥生物活性檢測方法進行開發和建立，使其生物活性檢測結果可信度更高，為貝伐珠單抗生物仿制藥臨床研究提供有力的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗檢測用 HUVEC 細胞株、基礎培養液（HUVEC-004B）、完全培養基（HUVEC-004）、FBS、生長因子添加劑購自澳賽爾斯生物技術（上海）有限公司；DMSO、明膠購自美國Sigma 公司；PBS、0.25% Trypsin-EDTA（1 ×）購自美國 Gibco 公司；VEGF165購自美國 Sino Biological 公司；Alarm Blue 和酶標儀均購自美國 Thermo 公司；Sensor Chip CM5 傳感芯片、HBS-EP + buffer（10 ×）、Biacore 儀器購自美國 GE 公司；標準品及樣品由東竺明生物技術有限公司提供；二氧化碳培養箱購自美國 Shell AB 公司。

1.2 方法

1.2.1 基于 HUVEC 增殖抑制法活性方法的開發

1.2.1.1 HUVEC 細胞培養 復蘇細胞前一天用 0.25% 的明膠溶液包被細胞培養瓶，明膠均勻分布在培養瓶底面，置 37 ℃培養箱中，放置過夜（至少放置 2 h），37 ℃水浴預熱完全培養基（HUVEC-004）。從液氮中取出細胞凍存管，快速將其置于 37 ℃水浴中解凍，放入生物安全柜中，將細胞轉移至加好培養基的細胞培養瓶中后，置于 37 ℃、5% CO2培養箱內培養。待復蘇后的細胞匯合度達到 80% 左右的時候，消化細胞并對細胞進行傳代、凍存或者鋪板。

1.2.1.2 VEGF 最適作用濃度的優化 確定合適的 VEGF 的作用濃度，使得在這種條件下，VEGF 對細胞具有最大的刺激生長的作用，藥物作用效果也更加明顯。

實驗過程如下：1% FBS HUVEC 基礎培養基，調整 HUVEC 活細胞密度至 1 × 105個/ml，100 μl/孔，加入 96 孔細胞培養板；接著用 1% FBS HUVEC 基礎培養基稀釋 VEGF 終濃度分別至 5、10、15、20、25、30、35、40 ng/ml，每個濃度 4 個復孔，100 μl/孔加入到細胞培養板中。37 ℃，5% CO2培養箱培養 96 h，加入 20 μl/孔AlarmBlue 檢測液，5% CO2培養箱中孵育顯色 6 h，在 530 nm 激發光和590 nm 發射光下，讀取熒光讀數（RFU），軟件分析得到曲線。

1.2.1.3 樣品作用濃度、稀釋倍數、梯度的優化 需要確定合適的樣品最佳起始濃度、稀釋倍數及稀釋梯度，使得在這種條件下，通過實驗結果繪制的標準曲線的窗口差值、抗體作用濃度點的分布最為理想，同時使實驗結果的可信度更高。

實驗過程如下：1% FBS HUVEC 基礎培養基，調整HUVEC 活細胞密度至 1 × 105個/ml，100 μl/孔，加入 96 孔細胞培養板；接著用 1% FBS HUVEC 基礎培養基稀釋 VEGF 至適宜濃度，作為 A液。用 A 液按以下條件稀釋單抗樣品：樣品起始濃度 80 μg/ml，3 倍稀釋，12 個梯度；樣品起始濃度 3 μg/ml，2 倍稀釋，9 個梯度；樣品起始濃度 3 μg/ml，3 倍稀釋，8 個梯度；樣品起始濃度 3 μg/ml，5 倍稀釋，8 個梯度。每個濃度 3 個復孔，100 μl/孔加入到細胞培養板中。37 ℃，5% CO2培養箱培養 96 h，加入20 μl/孔Alarm Blue 檢測液，5% CO2培養箱中孵育顯色6 h，在 530 nm 激發光和 590 nm 發射光下，讀取熒光讀數（RFU），軟件分析得到曲線。

1.2.1.4 專屬性驗證實驗 取抗 TNF-α 單抗、抗 RANKL 單抗、基礎培養液（HUVEC-004B）、抗 VEGF 單抗作為四種檢測樣品，按照以上優化好的條件進行實驗，驗證貝伐珠單抗仿制藥與 VEGF 的劑量線性關系。

1.2.1.5 線性及重復性驗證實驗 按照確定的方法配置標準品和樣品，連續進行 6 次檢測，讀取熒光讀數（RFU），曲線擬合，得到2值及 EC50值，計算 6 次實驗 EC50的 RSD 值。

1.2.1.6 準確性及中間精密度驗證實驗 按照確定的方法配置標準品和樣品，由 3 名檢測人員分別在三天實驗，每天兩次檢測，曲線擬合得到 EC50值，計算 6 次實驗 EC50的 RSD 值，同時，計算其相對生物活性值，相對生物活性值= 標準品 EC50/樣品 EC50。

1.2.2 基于表面等離子共振技術活性方法的開發 表面等離子共振（SPR）技術是一種基于物理光學特性的分析技術，Biacore 儀器是基于SPR 技術開發的新型生物傳感分析儀器[15]，本實驗以Biacore 為檢測儀器，以貝伐珠單抗標準品為配體，以 VEGF 為分析物，分別按照以下條件進行稀釋：配體濃度 1 μg/ml，分析物濃度 2.5 mg/ml；配體濃度 0.5 μg/ml，分析物濃度 2.3 μg/ml；配體濃度 0.25 μg/ml，分析物濃度 2.3 μg/ml，所有單循環進樣 120 s，再生液為3 mol/L 氯化鎂。根據以上實驗確定最佳多循環條件，多循環實驗時，分別稀釋配體及分析物至最佳濃度，分析物 VEGF 以最佳濃度為起始濃度，2 倍稀釋，7 個梯度。其中，設置中間濃度及零濃度，進樣 120 s，解離 800 s，再生液為 3 mol/L 氯化鎂。

1.2.3 貝伐珠單抗仿制藥樣品生物活性檢測 按照以上基于 HUVEC 增殖抑制法建立的活性檢測方法對貝伐珠單抗仿制藥樣品進行檢測，讀取熒光讀數（RFU），曲線擬合，得到其2值及 EC50值，并計算其相對生物活性值。同時按照以上基于 SPR 技術建立的活性檢測方法對貝伐珠單抗仿制藥樣品進行檢測，得到其抗原抗體親和力（KD）值，以及動力學曲線。

2 結果

2.1 基于 HUVEC 增殖抑制法活性方法的開發

所有實驗結果都通過 Graph Pad Prism 5 軟件分析并擬合曲線。

2.1.1 VEGF 最適作用濃度優化 為了確定最佳的 VEGF的作用濃度，使其對 HUVEC 的刺激效果最為明顯，本實驗選取了 8 個濃度點進行檢測，結果顯示，VEGF 30、35、40 ng/ml 的點都處于指數期，對 HUVEC 細胞都具有最大的刺激生長作用，同時出于成本考慮，選用 VEGF 30 ng/ml 作為實驗的最適作用濃度（圖 1）。

圖 1 VEGF 刺激 HUVEC 細胞增殖曲線

2.1.2 樣品作用濃度、稀釋倍數、梯度的優化 通過對樣品最適起始濃度，最佳稀釋倍數及梯度等條件進行優化，確定樣品的濃度作用范圍在 3 ~ 0.0013 μg/ml 之間，8 個濃度作用點，曲線擬合度較好。同時，樣品起始濃度 3 μg/ml，3 倍稀釋，8 個梯度曲線各濃度點分布較為理想，曲線擬合度最好，所以該檢測方法最終確定樣品起始濃度為 3 μg/ml，3 倍稀釋，8 個梯度（圖 2）。

圖 2 抗 VEGF 單克隆抗體抑制 HUVEC 細胞增殖曲線

2.1.3 專屬性驗證實驗結果 該方法下共設計 4 種專屬性溶液：抗 TNF-α 單抗、抗 RANKL 單抗、基礎培養液（HUVEC-004B）、抗 VEGF 單抗，其中僅在抗 VEGF 單抗溶液中呈現劑量關系的曲線，其他對照組 MAX/MIN ≈ 1，沒有任何與 VEGF 結合的活性（圖 3）。

2.1.4 線性及重復性驗證實驗結果 按照以上優化的實驗方法，連續進行 6 次實驗，實驗結果見表 1，所有 6 次檢測的2≥ 97%，滿足線性驗證可接受標準。6 個重復實驗之間樣品EC50的RSD < 25%。

2.1.5 準確性及中間精密度驗證實驗結果 3 人所做6 次檢測，相對生物活性的值均在70% ~ 130% 之間，符合準確性驗證標準。6 次實驗之間樣品EC50的RSD <25%（表 2）。

圖 3 專屬性驗證實驗曲線

表 1 線性及重復性實驗

表 2 準確性及中間精密度實驗

圖 4 標準品動力學和親和力擬合曲線

2.2 基于表面等離子共振技術活性方法的開發

實驗中，對配體以及分析物的濃度進行了摸索和優化，使分析物流過芯片表面所產生的響應值在50 RU 左右為宜，最終確定配體濃度 0.5 μg/ml，分析物濃度 2.3 μg/ml 為最佳實驗條件。同時以此條件的多循環動力學曲線見圖 4，該實驗結果的結合速率常數 Ka（1/Ms）值為 5.38E+05，解離速率常數 Kd（1/s）值為 1.27E-04，親和力 KD 值為2.36E-10，最大響應值 Rmax（RU）值為 38.24。

2.3 貝伐珠單抗仿制藥樣品生物活性檢測結果

以原研藥作為標準品，取貝伐珠單抗生物仿制藥研發階段的候選藥樣品，利用以上經過條件優化并且經過驗證的基于 HUVEC 增殖抑制法建立的活性檢測方法，對其進行抗 VEGF 的活性檢測，四參數擬合圖結果見圖 5，其中候選藥樣品的2值為 97.74%，標準品2值為 97.93%，候選藥的相對生物活性為 98.47%。同時按照以上基于 SPR 技術建立的活性檢測方法對該候選藥進行檢測，得到其結合速率常數 Ka（1/Ms）值為 8.46E+05，解離速率常數 Kd（1/s）值為 1.61E-04，親和力 KD 值為 1.90E-10，最大響應值 Rmax（RU）值為 66.91，動力學曲線見圖 6。

圖 5 候選藥抑制 H UVEC 細胞增殖曲線

3 討論

貝伐珠單抗已經被批準用于治療轉移性結直腸癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18-19]、多形性成膠質細胞瘤等[20-22]。2010 年1 月貝伐珠單抗在國內獲批上市。2015 年 7 月，肺癌適應證正式在中國獲批，用于晚期、轉移性或復發性非鱗非小細胞肺癌的一線治療。肺癌已經成為我國乃至世界發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，占肺癌的 80% 以上，死亡率很高[23]。每年每位患者治療費用約 38 萬元，昂貴的治療費用無疑給普通家庭帶來了極大的經濟負擔。降低治療成本，可以使患者更好地享受平等醫療的權利。因此，貝伐珠單抗生物仿制藥的研發工作具有極高的社會價值及臨床價值。隨著一些國家和地區貝伐珠單抗生物制品專利保護的相繼到期，在國際上掀起貝伐珠單抗生物類似藥仿制的熱潮。

生物仿制藥的生物活性是評價藥品質量安全的關鍵屬性之一，目前，抗體藥生物活性測定方法主要有基于細胞的生物活性測定法、基于新技術的生物活性測定法以及基于轉基因的細胞生物活性測定方法，其中基于細胞的生物活性測定法因其高效、特異性高、可操作性強等優點，是目前應用最廣的一種抗體藥的生物活性檢測方法，但該方法受仿制藥自身的研發環境、統計學模型的選擇、操作人員等方面的影響，要建立一套穩定的、準確的生物活性檢測方法，存在一定的難度；基于新技術的生物活性測定法具有靈敏度高、方法簡便、選擇性高等優點，是近幾年應用非常廣泛的新型檢測技術，但也因其儀器設備、試劑耗材價格昂貴，在實際的應用中受到了一定的限制；基于轉基因細胞的生物活性測定方法具有簡單、快速、靈敏等優點，近幾年在一些生物仿制藥的研發中也經常被用到，但也因該方法構建轉基因細胞株困難，需要對其穩定性、信噪比等參數進行優化和評價，在實際應用中也存在一定的困難。所以在實際研發工作中，在充分了解產品的作用機制和屬性的情況下，要基于新思路、新技術開發出一套可靠的生物活性檢測方法，以確保該產品有效、質量可控。

圖 6 候選藥動力學和親和力擬合曲線

本研究中貝伐珠單抗生物仿制藥生物活性檢測方法的開發主要應用了基于細胞的生物活性檢測方法（HUVEC 細胞測定法）以及基于新技術（SPR 技術）的生物活性測定方法，兩種方法相結合增加了貝伐珠單抗生物仿制藥的質量可靠性。在 HUVEC 增殖抑制法實驗中，采用反應性較好的 HUVEC 細胞作為檢測用細胞，最大程度地模擬了貝伐珠單抗生物仿制藥在體內抑制新生血管生成的過程，對 VEGF 的作用濃度、藥品（仿制藥樣品及原研藥）的濃度、稀釋倍數、稀釋梯度等條件進行了優化，建立檢測方法并進行了方法學的驗證，證明其特異性高、線性及重復性好、不同實驗之間的相對生物活性值高度一致，并運用該方法對貝伐珠單抗生物仿制藥研發階段的樣品進行了檢測，檢測結果的相對生物活性值為 98.47%，在可接受的標準范圍之內。同時，在基于表面等離子共振技術建立的活性檢測方法中，通過前期的實驗條件的摸索確定配體濃度 0.5 μg/ml，分析物濃度 2.3 μg/ml 為最佳實驗條件，并以此條件進行標準品及候選藥樣品的 Biacore 檢測，最后得到標準品及候選藥樣品的親和力 KD 值極為接近，動力學曲線幾乎相同。為了加快生物仿制藥快速發展的步伐，更多快速、簡便、準確的生物活性檢測方法需要在進一步的研究中摸索和建立。

此研究建立的兩種貝伐珠單抗生物仿制藥生物活性檢測方法高效、穩定、可靠性強，可作為該藥研發以及藥品穩定性評價階段的生物學活性檢測方法。

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肖莉杰，Email：371579562@qq.com

2017-11-25

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.015