HPLC法快速檢測重組人神經生長因子原液中醋酸殘留量

郭，白羊，章永壘，李義嘉，黃奮飛，陳勝亮，王明灶，陳星

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HPLC法快速檢測重組人神經生長因子原液中醋酸殘留量

361009 廈門，未名生物醫藥有限公司

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是最早發現的神經營養因子，其在神經細胞的生長、發育、分化、存活和損傷神經修復中起著重要的作用[1]。目前，臨床采用鼠頜下腺提取的 NGF 用于各類神經損傷的修復，療效顯著[2]。由中國倉鼠卵巢細胞（CHO 細胞）表達的重組人神經生長因子（rhNGF）相較于鼠神經生長因子（mNGF）具有活性更高、免疫風險更低的特點，具有廣闊的市場前景[3]。

CHO 細胞屬于外源細胞，其重組表達的蛋白、單克隆抗體等生物制品中可能會出現病毒污染，采用適宜的手段（如低 pH 孵育法）進行病毒滅活能有效提高生物制品的安全性[4]。在 CHO 細胞重組表達 rhNGF 工藝中，使用醋酸調節 pH 進行病毒滅活，再進一步超濾即得 rhNGF 原液。但醋酸屬于國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）規定的第三類溶劑，需要對產品中醋酸殘留量進行檢測[5]。高效液相色譜（HPLC）法是藥品檢測中應用最為廣泛的檢測方法，但目前尚無 HPLC 法檢測生物制品中醋酸含量的報道。本研究提供了一種能快速檢測醋酸含量的 HPLC 方法，以檢測 rhNGF 原液中的醋酸殘留量，為 rhNGF 的研發與生產提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Waters e2695 HPLC 儀、Waters 2998 PAD 檢測器、Empower 3 色譜工作站為美國 Waters 公司產品；十萬分之一電子天平為德國 Mettler Toledo公司產品；Milli-Q 純水器為美國 Millipore 公司產品。HP-C18 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）購自美國 Sepax 公司；醋酸對照品、NaH2PO4均購自比利時 Acros Organics 公司，純度 99.8%；色譜級甲醇購自美國 Fisher Chemical 公司；rhNGF 各工藝步驟原液（批次 20170401、20170402、20170403）由未名生物醫藥有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 方法 流動相為 10 mmol/L NaH2PO4水溶液（pH 2.98）:甲醇= 95:5，流速 1.0 ml/min；檢測波長 210 nm；柱溫 30 ℃；進樣量 20 μl。

1.2.2 對照品溶液制備 精密稱取醋酸對照品 25.000 mg，置于 25 ml 量瓶中，以流動相溶解，定溶，配制成 1 mg/ml 醋酸對照品儲備液。精密量取上述醋酸對照品儲備液適量于 25 ml 量瓶中，流動相稀釋至刻度，以 0.45 μm 濾膜濾過，即得不同濃度對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 精密量取 rhNGF 原液制備中使用醋酸的相關步驟樣品，包括低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液（超濾后樣品），根據醋酸濃度以流動相稀釋，以 0.45 μm 濾膜濾過，即得相應供試品溶液。

1.2.4 精密度試驗 精密量取醋酸對照品儲備液適量，制備成 0.25 mg/ml 醋酸對照品溶液重復樣 6 份，按“1.2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.5 專屬性試驗 分別取流動相、對照品溶液（醋酸濃度 0.1 mg/ml）、供試品溶液（rhNGF 原液）、供試品加標溶液（醋酸加標濃度 0.1 mg/ml），按“1.2.1”項下色譜條件測定，判斷對測量是否有干擾。

1.2.6 標準曲線制備與線性關系考察 精密量取醋酸對照品儲備液適量，制備成 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/ml 的系列對照品溶液。按“1.2.1”項下色譜條件進行分析測定，以對照品濃度（mg/ml）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 檢測限及定量限測定 將對照品溶液逐級稀釋后，按“1.2.1”項下色譜條件測定，直至噪聲信噪比不低于 10:1，得出定量限；繼續試驗直至信噪比不低于 3:1，得出檢測限。

1.2.8 回收率試驗 分別精密稱取同批 rhNGF 原液適量置于量瓶中，按照限度要求濃度（0.25 mg/ml，0.025%）的 80%、100%、120% 三個水平分別加入醋酸對照品儲備液，每個水平各制備 3 份，按“1.2.1”項下色譜條件進行檢測，測定醋酸含量，計算回收率和 RSD。

1.2.9 樣品測定 按“1.2.3”項下分別制備 3 批（20170401、20170402、20170403）的低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液等各工藝步驟供試品溶液，按“1.2.1”項下色譜條件進行檢測，測定 rhNGF 各工藝步驟供試品溶液中醋酸的殘留量。

2 結果

2.1 精密度試驗

平行進樣 6 次的醋酸峰面積分別為 169373、169159、167311、167909、167489、167989 mAU?min，均值為 168205 mAU?min，峰面積 RSD = 0.513%（n = 6）。表明本方法精密度良好，符合測定要求。

2.2 專屬性試驗

流動相、對照品溶液、供試品溶液（rhNGF 原液）、供試品加標溶液的色譜圖如圖 1 所示，空白溶劑、rhNGF 對醋酸出峰均無影響，對測定均無干擾。

2.3 線性關系考察

對濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg/ml的系列對照品溶液進行積分，以對照品濃度（mg/ml）為橫坐標，峰面積（）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程= 674578.4378– 440.2440（2= 1.0000）。結果表明，醋酸濃度0.010 ~ 1.000 mg/ml 范圍內線性關系良好（圖2）。

2.4 檢測限及定量限測定

將對照品溶液逐級稀釋后，直至噪聲信噪比不低于 10:1，得出定量限為 8.0 μg/ml；繼續試驗直至信噪比不低于 3:1，得出檢測限為 2.0 μg/ml。

2.5 回收率試驗

醋酸回收率試驗結果如表 1。80%、100%、120% 三個水平的回收率分別為101.667、101.111、100.741，RSD 分別為 0.820%、0.381%、0.318%，平均回收率為 101.173%，RSD 為 0.506%，符合檢測要求。

2.6 樣品測定

低 pH 孵育前樣品、低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液（超濾后樣品）等各工藝步驟供試品檢測圖譜見圖 3。3 批工藝中低 pH 孵育前樣品均未檢出醋酸，而低 pH 孵育樣品、rhNGF 原液有檢出醋酸，結果見表 2。3 批 rhNGF 原液中醋酸殘留量分別為 0.086、0.068、0.058 mg/ml，低于醋酸殘留限度 0.25 mg/ml（0.025%）。一步超濾對醋酸的去除率高達 99.474%、99.598%、99.654%（平均 99.576%），可以確保 rhNGF 原液中醋酸合格。

圖 1 專屬性試驗色譜圖（A：流動相；B：對照品溶液；C：供試品溶液；D：供試品加標溶液；1：醋酸峰）

圖 2 醋酸濃度與峰面積相關性回歸曲線

表 1 醋酸回收率試驗結果

圖 3 各工藝步驟供試品色譜圖[A：流動相；B：低 pH 孵育前樣品；C：低 pH孵育樣品（稀釋 20 倍）；D：rhNGF 原液（超濾后）；1：醋酸峰]

3 討論

CHO 細胞屬于哺乳動物細胞，與其他表達系統相比，CHO 表達系統具有準確的轉錄后修飾功能，表達的蛋白在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近于天然蛋白分子，其在重組蛋白、單克隆抗體表達發明的應用也越來越廣泛[6]。但 CHO 細胞來源于中國倉鼠，細胞本身和生產工藝導致產品出現病毒污染的可能性[7]。因此，國家食品藥品監督管理總局（CFDA）要求在生產工藝中必須加入經驗證的病毒滅活步驟，以此排除可能污染的感染性活病毒，有效控制制品的病毒安全性[8]。

低 pH 孵育是常用的病毒滅活手段，其使用方便、工藝穩定可靠，且無病毒滅活劑（如辛酸鈉、磷酸三丁酯等）殘留的問題，因此常與柱層析工藝聯合應用在病毒滅活/去除中[4, 9]。醋酸酸性較弱，反應較溫和，是目前低 pH 孵育中使用較多的酸類，如在 CHO 細胞表達的 rhNGF 工藝中使用醋酸調節 pH 進行病毒滅活，再以磷酸緩沖液進行超濾置換，即得 rhNGF 原液。

醋酸是 ICH 規定的第三類溶劑，急性毒性或短期毒性試驗表明這類溶劑幾乎無毒、無遺傳毒性，其允許的日接觸量（PDE）為 50 mg 或以上，ICH Q3c 和中國藥典 2015 年版《通則 0861：殘留溶劑測定法》規定其限度為 0.5%[5, 10]。一般來說，僅需要對在終產品精制過程中使用的第三類溶劑進行殘留量研究，但在新藥的研發過程中，有必要對所有使用到的有機溶劑進行溶劑殘留水平的合理性論證，使藥品的安全性得到最大保證[10-11]。

目前，化學藥物中醋酸殘留檢測主要針對原料藥，如胸腺五肽的醋酸限度為0.5%[12]，而生物制品則尚未有具體參照。中國藥典 2015 年版三部《人血白蛋白》各論中對同屬于第三類溶劑的乙醇規定為人血白蛋白原液中乙醇殘留量限度應不高于 0.025%，遠低于 0.5% 的常規乙醇殘留量限度標準[13]。為最大程度保證藥物的安全性，本研究參照上例嚴格限定 rhNGF 原液中的醋酸殘留量，將標準定為醋酸殘留量限度應不高于 0.025%（0.25 mg/ml）。

前期研究表明，醋酸殘留量檢測多采用毛細管氣相色譜法[11, 14]、離子色譜法[15]、HPLC 法[16]，其中氣相色譜法 FID 檢測器對醋酸響應值低于其他有機試劑，且檢測結果易受氣流穩定性影響，重現性不佳；離子色譜法檢測醋酸近年來多有報道，但其對儀器要求較高，且電導檢測器通用性較差，導致其在藥企配置率不高，推廣應用受到限制；而 HPLC 法操作簡單，分析速度快，通用性強，是目前藥企配置的最基本檢測儀器之一，建立適用的 HPLC 法檢測生物制品原液中醋酸殘留量是十分必要且有推廣意義的。

因此，本研究采用 C18 反相色譜柱，建立以 10 mmol/L NaH2PO4水溶液-甲醇作為流動相進行等度洗脫的 HPLC 快速檢測方法，實驗結果表明本方法精密度、專屬性、線性良好，定量限和檢測限低，回收率符合規定，適用于 rhNGF 原液中醋酸殘留檢測；低 pH 值孵育后進行一步超濾的 rhNGF 原液中醋酸殘留量為 0.058 ~ 0.082 mg/ml，低于醋酸殘留限度 0.25 mg/ml（0.025%），一步超濾對醋酸的去除率高達 99.576%，可以確保 rhNGF 原液中醋酸殘留量符合規定。本方法的建立為加快 rhNGF 的工業化生產提供了實驗依據，并可推廣至輔料中不含冰醋酸、醋酸鈉的各類生物制品原液中醋酸殘留量的檢測，為生物制品新藥研發提供理論參考。

表 2 各工藝步驟醋酸含量

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國家“重大新藥創制”科技重大專項（2011ZX09401-017）

陳星，Email：amable24@163.com

2017-12-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.014