新型培美曲塞衍生物對A549細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡的影響

劉秀，賈玉萍，賈慶文，郭中坤，王可洲，盧美超，劉莎，袁棟棟

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新型培美曲塞衍生物對A549細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡的影響

劉秀，賈玉萍，賈慶文，郭中坤，王可洲，盧美超，劉莎，袁棟棟

250200 濟南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院（劉秀、郭中坤、王可洲）；250101 濟南，山東省藥學(xué)科學(xué)院（賈玉萍、賈慶文、盧美超、劉莎、袁棟棟）；250002 濟南，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省實驗動物中心（郭中坤、王可洲）

探究新型培美曲塞（PMX）衍生物對 A549 細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡的影響。

MTT 法初步篩選 12 種化合物對 A549 細(xì)胞的細(xì)胞毒性，篩選出高活性候選化合物進一步研究其對A549 細(xì)胞增殖的影響；Transwell 細(xì)胞遷移實驗及劃痕愈合實驗測定候選化合物對 A549 細(xì)胞遷移的影響；流式細(xì)胞術(shù)測定候選化合物對 A549 細(xì)胞凋亡的影響。

初篩發(fā)現(xiàn)其中 9 種化合物對 A549 細(xì)胞增殖具有抑制作用，其中化合物 A12 抑制作用最為顯著，IC50為（1.26 ± 0.15）μmol/L，且抑制作用存在濃度及作用時間依賴性：IC50在作用 72 h 處最低，為（1.06 ± 0.24）μmol/L；Transwell 細(xì)胞遷移實驗及劃痕愈合實驗結(jié)果表明 A12 能夠抑制 A549 細(xì)胞的遷移能力，且抑制作用具有濃度依賴性；流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果顯示 A12 能夠顯著提高 A549 細(xì)胞的早期凋亡率（< 0.05）、晚期凋亡壞死率（< 0.01）及總凋亡率（< 0.05）。

篩選得到的新型 PMX 衍生物 A12 能夠明顯抑制 A549 細(xì)胞的增殖及遷移活性，并能誘導(dǎo)其凋亡。

細(xì)胞增殖； 細(xì)胞遷移抑制； 細(xì)胞凋亡； 培美曲塞衍生物； A549 細(xì)胞

二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）是葉酸代謝過程中必不可少的酶，能夠催化二氫葉酸轉(zhuǎn)化為四氫葉酸，進而參與生物合成。DHFR 抑制劑能選擇性地與 DHFR結(jié)合，阻止或抑制正常底物與酶的結(jié)合，阻礙葉酸代謝，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而達(dá)到治療腫瘤等目的[1]。近年來，由于其明顯的活性，DHFR 抑制劑在對抗一些病原體和腫瘤細(xì)胞方面引起了廣泛的研究[2]。培美曲塞（pemetrexed，PMX）作為 DHFR 抑制劑的常用藥物之一，主要用于惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）及非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）的二線治療[3-4]。為了檢測新型培美曲塞衍生物對人肺癌細(xì)胞 A549 細(xì)胞的毒性，以及篩選出合適的化合物及濃度進行后續(xù)機制研究，本文首先采用 MTT 法檢測了不同濃度的不同化合物對 A549 細(xì)胞活力的影響，從中選擇一種化合物，并選擇其合適的濃度進行細(xì)胞遷移實驗、劃痕愈合實驗及流式細(xì)胞術(shù)實驗，從而檢測該濃度的化合物是否對 A549 細(xì)胞的遷移活力及細(xì)胞凋亡存在影響。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材

1.1.1 試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基為賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品；新生牛血清為浙江天杭生物科技股份有限公司產(chǎn)品；MTT 為 Biosharp 公司產(chǎn)品；DMSO、甲醇（分析純）為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液（100 ×）、胰蛋白酶-EDTA 消化液、吉姆薩染液、Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒為 Solarbio 公司產(chǎn)品；氟尿嘧啶注射液（5-Fu）為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 器材 Transwell、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國 Costar 公司；水套式 CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技公司；SW-CJ-2FXS 超凈工作臺購自蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；Spectra Max I3 多功能酶標(biāo)儀購自美國 MD 公司；倒置生物顯微鏡購自重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；Guava easy cyte 6 HT-2L 流式細(xì)胞儀購自美國默克密理博公司；常溫低速離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；ZD-9556 水平搖床購自太倉市科教器材廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞培養(yǎng)于含有 10% 新生牛血清、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于 37 ℃、5% CO2、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗[5]。

1.2.2 MTT 法檢測化合物（A1 ~ A12）對 A549 細(xì)胞的毒性 取處于對數(shù)生長期的 A549 細(xì)胞，消化離心之后，調(diào)整細(xì)胞濃度至 5 × 104個/ml，取 100 μl 接種于 96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后，各孔分別加入對應(yīng)化合物 100 μl，使終濃度分別為 200、40、8、1.6、0.32 μmol/L，每組設(shè) 3 個復(fù)孔，同時設(shè)陰性對照孔（PMX）、陽性對照孔（5-Fu），96 孔板四周孔用培養(yǎng)基填充。加藥完畢，96 孔板置于 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 44 h 后，每孔加入5 mg/ml MTT 溶液 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，小心吸去上清，加入 DMSO 100 μl，振蕩 5 min。用酶標(biāo)儀測定振蕩之后的 96 孔板在 570 nm 處的光密度值（570 nm）。計算各個化合物對 A549 細(xì)胞的增殖抑制率及 IC50[6-7]。

1.2.3 化合物不同作用時間對 A549 細(xì)胞毒性及細(xì)胞形態(tài)觀察 根據(jù) MTT 實驗結(jié)果挑選出一種化合物，并進行不同作用時間（8、24、48、72 h）MTT 實驗，各孔終濃度為 8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μmol/L，在加入 MTT 溶液之前，將 96 孔板置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[8]。

1.2.4 Transwell 細(xì)胞遷移實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化計數(shù)，用無血清 RPMI1640 培養(yǎng)基調(diào)整濃度為 5 × 105個/ml。上室分別加入 200 μl 含有不同藥物濃度（A12：1、0.5、0.25、0.125、0 μmol/L，5-Fu：1 μmol/L）的細(xì)胞懸液；下室加入 800 μl 含 10%新生牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基，藥物終濃度與上室相同，在 37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 h 后用鑷子小心取出上室，吸干上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞，移到預(yù)先加入 800 μl 甲醇的孔中，室溫固定 30 min；取出上室，吸干固定液，移到預(yù)先加入 800 μl 吉姆薩染液的孔中，室溫染色 30 min；輕輕用純水沖洗浸泡數(shù)次，取出上室，吸去上室液體，在倒置顯微鏡下隨機選取 6 個視野拍照計數(shù)[9]。

1.2.5 劃痕愈合實驗 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板在使用前，預(yù)先用水性筆在底部劃 5 條平行直線作為位置標(biāo)識。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 1 × 105個/ml，鋪于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 1 ml 細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，觀察細(xì)胞呈現(xiàn)融合生長狀態(tài)，進行劃痕。吸去培養(yǎng)液，用 100 μl 無菌槍頭在各孔底部均勻地劃 2 條與所劃標(biāo)識垂直的直線。劃痕結(jié)束后用 PBS清洗3 遍，以去除劃下的細(xì)胞。各孔分別加入不同濃度的藥物（A12：1 μmol/L；5-Fu：1 μmol/L），同時設(shè)陰性對照組，每個濃度設(shè) 3 個復(fù)孔。在倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，此時間點設(shè)置為 0 h，6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h 后，再拍照并觀察劃痕愈合程度[10]。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡的變化 用新鮮培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為 1 × 105個/ml，鋪于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 1 ml 細(xì)胞，貼壁后向每孔加入含有相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基，設(shè)陰性對照組、藥物處理組（A12 終濃度分別為 1 μmol/L、0.5 μmol/L），陽性對照組（5-Fu）終濃度為 1 μmol/L，加藥完畢后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液至 10 ml 離心管中，PBS 清洗 2 遍后，胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，細(xì)胞變圓后加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁吹打下來，再次收集，1000 r/min 離心 5 min，小心吸除上清，加入預(yù)冷 PBS，重懸洗滌細(xì)胞，再次離心，小心吸除上清。加入 1 ml 染色緩沖液（1 ×）重懸細(xì)胞，1000 r/min 離心 5 min，小心吸除上清，加入適量染色緩沖液（1 ×）重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到 1 × 106個/ml。取 100 μl 細(xì)胞懸液于 1.5 ml 離心管中。向 1.5 ml 離心管中加入 5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光染色 10 min 后，加入 5 μl PI 染液，輕輕混勻后室溫避光孵育 5 min。加入染色緩沖液（1 ×）至 500 μl，輕輕混勻。在染色后 1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC 是綠色熒光，PI 是紅色熒光[11-12]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測細(xì)胞毒性結(jié)果

化合物對 A549 細(xì)胞作用 48 h 后，MTT 法檢測各個化合物的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明化合物 A1、A6、A7、PMX 對 A549 細(xì)胞增殖無抑制作用（IC50> 200 μmol/L），其余化合物存在不同程度的抑制作用，其中 A12 對 A549 細(xì)胞增殖的抑制作用較明顯[IC50=（1.26 ± 0.15）μmol/L]，且強于 5-Fu[IC50=（6.27 ± 2.29）μmol/L]，由此選用化合物 A12 進行后續(xù)實驗，具體數(shù)值如表 1 所示。

2.2 化合物 A12不同作用時間對 A549 細(xì)胞毒性與形態(tài)的影響

PMX 衍生物 A12 進行不同作用時間（8、24、48、72 h）MTT 實驗并拍照，結(jié)果如表 2 所示。A12 對 A549 細(xì)胞增殖存在明顯的抑制作用，且抑制作用存在濃度及作用時間依賴性：細(xì)胞存活率隨著濃度的提高而降低，IC50在作用 72 h 處最低，為（1.06 ± 0.24）μmol/L。通過倒置顯微鏡觀察各孔的細(xì)胞形態(tài)，陰性對照孔細(xì)胞邊緣整齊，細(xì)胞生長狀態(tài)良好；A12 處理后的 A549 細(xì)胞數(shù)明顯少于陰性對照組，有極少部分細(xì)胞體積變小、形態(tài)變圓，而 5-Fu 處理后的 A549 細(xì)胞，不僅細(xì)胞數(shù)少，還出現(xiàn)染色質(zhì)固縮及明顯的細(xì)胞核形態(tài)改變。

2.3 Transwell 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果

化合物 A12 不同濃度作用 8 h 后，對 A549 細(xì)胞遷移能力影響結(jié)果如圖 1 及圖 2所示：陰性對照組細(xì)胞遷移數(shù)為（183.75 ± 2.71）個，A121、0.5、0.25、0.125 μmol/L 組細(xì)胞遷移數(shù)分別為 74.25 ± 1.30、105.17 ± 0.24、112.92 ± 0.35、140.25 ± 1.30 個，遷移抑制率分別為 59.59%、42.77%、38.55%、23.67%，陽性對照組（5-Fu 1 μmol/L）細(xì)胞遷移數(shù)83.42 ± 0.12 個，遷移抑制率為 54.60%。隨著作用藥物濃度的提高，遷移至膜底部的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，遷移抑制率逐漸提高，且相同作用濃度下，化合物 A12 抑制遷移結(jié)果優(yōu)于 5-Fu，此結(jié)果表明化合物 A12 能夠有效抑制 A549 細(xì)胞的遷移，且抑制作用具有濃度依賴性。

表 1 化合物對 A549 細(xì)胞增殖的抑制作用初篩結(jié)果

表 2 不同作用時間點化合物 A12 對 A549 細(xì)胞的增殖活性抑制結(jié)果

Figure 1 Effect of compound A12 on the migration of A549 cells (A: Negative control group; B: 1 μmol/L group; C: 0.5 μmol/L group; D: 0.25 μmol/L group; E: 0.125 μmol/L group; F: Positive control group)

圖 2 不同濃度化合物 A12 對 A549 細(xì)胞遷移能力影響統(tǒng)計學(xué)分析（與陰性對照組比較，**P < 0.01）

Figure 2 Effect of compound A12 on the migration of A549 cells statistical analysis (Compared with negative control group,**< 0.01)

圖 3 化合物 A12 對 A549 細(xì)胞劃痕愈合能力的影響

Figure 3 Effect of compound A12 on the wound healing ability of A549 cells

2.4 劃痕愈合實驗結(jié)果

化合物 A12 對劃痕后的 A549 細(xì)胞作用 24 h后，倒置顯微鏡拍照并觀察劃痕線附近A549 細(xì)胞的愈合情況及生長狀態(tài)，結(jié)果表明：陰性對照組在劃痕 24 h 后，與此組 0 h 狀態(tài)對比，劃痕兩側(cè)細(xì)胞分別向?qū)?cè)生長，劃痕間距明顯縮小，由（0.90 ± 0.02）mm 縮短至（0.21 ± 0.02）mm；A12 作用24 h 后，劃痕間距由（0.83 ± 0.02）mm 縮短至（0.62 ± 0.03）mm，抑制愈合率為 74.10%，提示A12 作用后，A549 細(xì)胞的運動能力減弱，且同種作用濃度（1 μmol/L）下，A12 對 A549 細(xì)胞的抑制運動作用強于陽性對照組。結(jié)果如圖 3 所示。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡影響結(jié)果

化合物 A12 對 A549 細(xì)胞作用 48 h 后，對細(xì)胞凋亡的影響見表 3。與陰性對照組比較，A12 能夠顯著提高 A549 細(xì)胞的早期凋亡率（< 0.05）、晚期凋亡壞死率（< 0.01）及總凋亡率（< 0.05），且相同作用濃度（1 μmol/L）下，對 A549 細(xì)胞凋亡的影響優(yōu)于陽性對照組。此結(jié)果表明：化合物 A12 能夠誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡，從而抑制其增殖。

表 3 化合物 A12 對 A549 細(xì)胞凋亡影響結(jié)果

注：*< 0.05，與陰性對照組比較；**< 0.01，與陰性對照組比較。

Note:*< 0.05 vs. negative control group;**< 0.01 vs. negative control group.

3 討論

肺癌作為惡性腫瘤，即使處于 I 期的腫瘤患者，其術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險也高于其他腫瘤患者，且預(yù)后較差[13]。腫瘤治療失敗的原因主要是復(fù)發(fā)和發(fā)生重要臟器的轉(zhuǎn)移，細(xì)胞的遷移現(xiàn)象是細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的濃度梯度后而產(chǎn)生的移動。因此，這就要求抗腫瘤藥物不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，還能夠有效阻遏其遷移至其他臟器，進而影響疾病的發(fā)生和進程，改善預(yù)后。DHFR 抑制劑作為近年來抗腫瘤藥物的研究熱點，具有較為廣泛的抗腫瘤作用，其中 PMX 作為經(jīng)典 DHFR 抑制劑的代表藥物已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于 MPM 的一線治療及 NSCLC 的二線治療，在我國于 2005 年被批準(zhǔn)上市，適應(yīng)證為 MPM。目前，臨床上對于 NSCLC 的治療還存在很多困難，沒有理想的治療方案，還需進一步的研究探索。并且，雖然國內(nèi)已有企業(yè)能夠生產(chǎn) PMX，但其質(zhì)量尚有待提高，均在純度不高及雜質(zhì)較多方面存在不足，對 PMX 采用的試行標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定其含量為 98.5%，總雜質(zhì)≤ 1.0%，此標(biāo)準(zhǔn)也有進一步提高的可能[14]。本實驗采用 PMX 原料藥作為對照，結(jié)果表明其對 A549 細(xì)胞毒作用不顯著（IC50> 200 μmol/L），提示需進一步提高純度，減少雜質(zhì)，且存在水溶液穩(wěn)定性不佳等問題，影響其效果。

同時，有研究報道，PMX 臨床治療肺癌過程中，可與多種藥物聯(lián)用，但禁忌與二線和三線化療藥物配合使用[15]，并且存在中性粒細(xì)胞減少等血液學(xué)毒性及黏膜炎、敗血癥、膿毒癥等不良反應(yīng)[16]，之前進行過同類方案化療的患者可能敏感性不佳，易產(chǎn)生耐藥性等缺點，促使對培美曲塞合成方案及結(jié)構(gòu)進行進一步優(yōu)化。為增強其在一線治療及維持治療中的療效及減少不良反應(yīng)提供思路，本文選取新型 PMX 衍生物進行 MTT 實驗及 transwell 細(xì)胞遷移實驗，評價其對人肺癌細(xì)胞 A549 細(xì)胞增殖、遷移活力的影響，結(jié)果表明能夠顯著抑制 A549 的增殖及遷移能力（< 0.01），并且這種抑制作用具有濃度依賴性，此結(jié)果與之前結(jié)果一致[17]。同時進行劃痕愈合實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)待測化合物組24 h 后劃痕間距與 0 h 相比，縮短較少距離，愈合抑制率為74.10%，且優(yōu)于陽性對照組，表明其能夠有效阻滯 A549 細(xì)胞的劃痕愈合，此結(jié)果與 transwell 細(xì)胞遷移實驗結(jié)果一致，進一步證實此種 PMX 衍生物不僅能夠抑制 A549 細(xì)胞的增殖，而且能夠有效阻滯癌細(xì)胞遷移至其他組織。流式細(xì)胞實驗結(jié)果表明，此類 PMX 衍生物發(fā)揮抑制 A549 細(xì)胞增殖作用與引起細(xì)胞凋亡有關(guān)。本次新型 PMX 衍生物體外實驗結(jié)果表明其對肺癌 A549 細(xì)胞具有良好的抑制效果，且效果優(yōu)于 PMX，為深入研究其機制及結(jié)構(gòu)改造奠定基礎(chǔ)，也為今后的臨床應(yīng)用提供可能。

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Study on the effects of new pemetrexed derivatives on the proliferation, migration and cell apoptosis of A549 cells

LIU Xiu, JIA Yu-ping, JIA Qing-wen, GUO Zhong-kun, WANG Ke-zhou, LU Mei-chao, LIU Sha, YUAN Dong-dong

Author Affiliations: School of Medicine and Life Science, University of Jinan & Shandong Academy of Medical Science, Jinan 250200, China (LIU Xiu, GUO Zhong-kun, WANG Ke-zhou); Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Jinan 250101, China (JIA Yu-ping, JIA Qing-wen, LU Mei-chao, LIU Sha, YUAN Dong-dong); Shandong Laboratory Animal Center, Shandong Academy of Medical Science, Jinan 250002, China (GUO Zhong-kun, WANG Ke-zhou)

To detect the effects of new pemetrexed (PMX) derivatives on the proliferation, migration and cell apoptosis of A549 cells.

The cytotoxicity of 12 compounds to A549 cells was preliminarily screened by MTT method, and candidate compounds with high activity were selected for further research on the proliferation of A549 cells. Effects of candidate compounds on A549 cells migration were detected by transwell cell migration assay and the wound healing assay. Effects of candidate compounds on the cell apoptosis of A549 cells were detected by flow cytometry.

The results of preliminary screening of 9 compounds could inhibit the proliferation of A549 cells, with compound A12 the inhibitory effect was the most significant, IC50(1.26 ± 0.15) μmol/L, and the inhibition was concentration and time dependent: the IC50in the lowest at 72 h was (1.06 ± 0.24) μmol/L; Transwell cell migration assay and the wound healing assay showed that the migration ability of A12 could inhibit A549 cells, and the inhibition was concentration dependent; Flow cytometry results showed that A12 can significantly improve the early apoptosis rate of A549 cells (< 0.05), late apoptosis and necrosis rate (< 0.01) and total apoptosis rate (< 0.05).

The new PMX derivative, A12, could inhibit the proliferation and migration activity of A549 cells and induced apoptosis.

Cell proliferation; Cell migration inhibition; Apoptosis; Pemetrexed derivatives; A549 cells

WANG Ke-zhou, Email: wangkezhou_cn@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.006

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD050160202)；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項資金項目（CXLC161906）；山東省自然科學(xué)基金（ZR2015YL036）；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程

王可洲，Email：wangkezhou_cn@163.com

2018-01-17