乙酰肝素酶對血管內皮細胞增殖、遷移及血管活性因子表達的影響

王靜，吳嬋，周睿，岑山，徐斌

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乙酰肝素酶對血管內皮細胞增殖、遷移及血管活性因子表達的影響

王靜，吳嬋，周睿，岑山，徐斌

100050 北京，中國醫學科學院醫藥生物技術研究所免疫室（王靜、周睿、岑山）；100038 北京，首都醫科大學附屬復興醫院神經內科（吳嬋、徐斌）

檢測乙酰肝素酶（HPA）過表達對血管內皮細胞增殖、遷移及血管活性因子表達的影響，進一步揭示 HPA 參與調節動脈粥樣硬化斑塊內血管新生過程的作用機制。

構建 HPA 基因的過表達載體，轉染 HUVEC 細胞。利用 Western blot檢測 HPA 蛋白的過表達情況。利用 CCK8 法檢測細胞增殖情況，細胞遷移實驗檢測 HPA 對細胞遷移能力的影響。利用 Western blot 檢測 HPA 對 Ang2 和 Tie2 蛋白表達的影響。

構建的 HPA 表達載體轉染 HUVEC 細胞后可使 HPA 蛋白水平明顯上調。隨著轉染時間的增加，HPA 轉染組的相對增殖率可達對照組的 2 ~ 3 倍。HPA 轉染組的穿膜細胞數明顯多于對照組。HPA 轉染組的 Ang2 和 Tie2 的蛋白表達水平高于對照組。

HPA 過表達可提高 HUVEC 細胞的增殖和遷移能力，促進血管活性分子Ang2 和 Tie2 的表達，提示 HPA 可能通過調控 Ang2/Tie2 的表達來影響易損斑塊內病理性血管新生。

乙酰肝素酶； 病理性血管新生； 血管活性分子

缺血性腦卒中具有高發病率、高死亡率、高致殘率以及高復發率的特點，成為威脅人類健康和生命的主要疾病之一[1-2]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，As）易損斑塊破裂及其導致栓子脫落引起血栓形成是導致缺血性腦卒中事件的重要病因之一[3-4]，因此斑塊穩定性問題越來越引起人們的重視。病理學研究發現，斑塊內病理性血管新生的存在和程度與斑塊破裂及臨床腦血管事件相關[5]。斑塊內病理性新生血管的增多，導致斑塊內出血風險增加，高危易損斑塊形成，進而引起斑塊內不穩定事件鏈循環往復。G?ssl 等[6]發現，尸解冠狀動脈粥樣硬化斑塊可見大量新生血管形成。對人類進展期動脈粥樣硬化斑塊的研究證明血管新生與易損斑塊之間存在明顯的相關性[7]。綜上所述，病理性血管新生在易損斑塊的發展中發揮著至關重要的作用。

乙酰肝素酶（heparanase，HPA）是哺乳動物體內唯一能夠降解細胞表面及細胞外基質中硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPGs）的 β-D-葡糖醛酸內切酶[8-9]。As 易損斑塊形成和進展過程中的具體作用機制非常復雜，目前研究顯示 HPA 可通過促進斑塊內炎性反應、與蛋白水解酶協同作用以及參與血液高凝狀態等參與易損斑塊形成[10]。腫瘤學研究表明，HPA 可通過降解基底膜和細胞外基質，釋放和活化血管內皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）及血管生成素（Ang）等多種血管生長因子，進而參與調節血管新生[11-12]。但目前關于 HPA 參與調節 As 斑塊內血管新生過程的具體作用機制尚不清楚。

研究表明，HPA 主要表達于As 斑塊中的巨噬細胞，且與斑塊內病理性血管新生有著密切聯系[13-14]。鑒于在腫瘤學研究中，HPA 通過釋放血管活性因子參與腫瘤血管新生[15-16]，Ang 家族成員可作用于特異受體酪氨酸激酶受體 2（Tie2），參與腫瘤新生血管的形成、延續，影響腫瘤的生長、侵襲和轉移[17-18]。同時，我們前期研究顯示，與正常動脈段相比，As 斑塊內 HPA 表達及新生血管形成均增多，且 HPA 表達與病理性血管新生密切相關[19-20]。As 斑塊內 Tie2 表達增高，且與病理性血管新生呈正相關。我們推測，HPA 可能通過 Ang/Tie2 通路參與調節 As 易損斑塊內的血管新生。因此，為了進一步探討 As 斑塊內 HPA 在病理性血管新生過程中的作用機制，本文將通過在血管內皮細胞中上調 HPA 基因的表達，研究其對血管內皮細胞的增殖、遷移及多種血管活性因子表達的影響，并期望能為全面理解 HPA 在調控血管新生及尋找干預 As 易損斑塊形成和發展的新靶點提供重要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和質粒 HEK293T 細胞為本實驗室自有；人臍靜脈內皮細胞HUVEC 由軍事醫學科學院惠贈；人源HPA 基因表達質粒通過 PCR 擴增、酶切后連接到 pTT3 真核表達載體獲得。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM、含 EDTA 的 0.25% 胰酶、FBS 及Neon 轉染系統試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；甲醛和結晶紫為本室自有；CCK8 活性測定試劑盒及細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；細胞裂解液購自美國 Promega 公司；HPA 抗體、Tie2 抗體、Ang2 抗體及 β-actin 抗體購自英國 Abcam 公司；辣根酶標記山羊抗小鼠二抗和辣根酶標記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術公司；增強型化學發光液（ECL）購自美國 Millipore 公司。細胞電轉儀 NeonTMTransfection System 購自美國 Invitrogen 公司；熒光顯微鏡購自德國 Carl Zeiss 公司；680 型Microplate Reader 酶標儀、PowerPacTMHC Power Supply 蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot 蛋白轉膜儀及 Gel DocTMXR+ 凝膠成像儀均為美國 Bio-Rad 公司產品。

1.2 方法

1.2.1 HPA 基因表達質粒的構建 在 NCBI 中查找人源 HPA 基因（Genbank AF165154.1）的 CDS 序列（1632 bp），利用基因克隆技術，成功構建以 pTT3 為載體骨架的 HPA 基因真核表達質粒 HPA-Bio-His，經英駿生物技術公司測序鑒定序列正確。

1.2.2 HPA 表達質粒電穿孔轉染HUVEC 細胞 取對數生長期的 HUVEC 細胞，棄去培養基，PBS 沖洗 1 次，加入胰酶消化成細胞懸液，細胞懸液以800 r/min 離心5 min，棄上清，用 PBS 洗滌一次，離心棄上清，調整細胞密度為5 × 107個/ml。電穿孔方法轉染采用 Invitrogen NeonTMTransfection System 進行，操作方法參見其使用手冊，其中電轉儀參數設置為 1100 V，30 ms，2 個電脈沖。

1.2.3 CCK8 法檢測細胞增殖 取生長良好的HUVEC 細胞進行電穿孔轉染，轉染后的細胞接種于 96 孔板（密度約為 5 × 107個/ml），設立實驗組（轉染 HPA 質粒）、對照組（轉染空載體）、空白組（不加細胞，只含培養液）、陰性對照組（只含細胞），每組設 8 個復孔。檢測時，細胞上清更換為含有 10% CCK8 試劑的細胞培養液，細胞在 37 ℃、5% 二氧化碳孵箱中繼續培養 1 h，使用 EnSpire 2300 多功能酶標儀檢測 450 nm 處光吸收。

1.2.4 Transwell 體外遷移實驗 選用 8.0 μm孔徑的 transwell 小室進行實驗。取對數生長期的 HUVEC 細胞，棄去培養基，PBS 沖洗 1 次，加入胰酶消化成細胞懸液，并調整細胞數為 5 ×107個/ml 進行電穿孔轉染實驗。設立實驗組及對照組，分別電轉染 500 ng 空載體和 HPA 質粒。將 100 μl電轉染后的細胞懸液加入 transwell 上室。然后取含有 20% FBS 的 DMEM 培養基500 μl加入下室。5% 二氧化碳培養箱 37 ℃正常培養 48 h。棉簽擦去上室膜內細胞，甲醛固定20 min；0.5% 結晶紫室溫染色 10 min，雙蒸水漂洗至多余顏色除去。Transwell 小室置于顯微鏡下觀察膜下表面細胞，以膜下細胞的數量表示遷移能力，隨機選取視野拍照并計數。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達情況 HEK293T 細胞和 HUVEC 細胞分別轉染 500 ng 空載體和 HPA 質粒，48 h 后用 80 μl RIPA 細胞裂解液裂解細胞，旋渦振蕩后再加入 20 μl 5 × 蛋白上樣緩沖液裂解細胞。金屬浴 100 ℃加熱 40 min。取等量總蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，使用 PVDF 膜 70 V 恒壓濕法轉膜 1 h 后，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h。先后與一抗和二抗孵育，最后 ECL 顯色。Western blot 條帶利用 Image J 軟件進行定量分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 HPA 基因質粒的表達檢測

在 HUVEC 細胞中電穿孔轉染 HPA-Bio-His 表達質?；蚩蛰d體，48 h后收取細胞，提取總蛋白，利用Western blot 實驗檢測 HPA 的表達情況。結果顯示，與空載體的對照組相比，HPA-Bio-His 表達質粒能夠在 HUVEC 細胞中正確表達（圖 1A），且 Western blot 條帶的定量分析結果顯示， HPA-Bio-His 質粒轉染細胞后可使 HPA 蛋白表達量提高 1.5 以上（圖 1B），可用于后續 HPA 過表達相關實驗的研究。

圖 1 HPA 在 HUVEC 細胞中的過表達情況（A：HPA 蛋白水平；B： Western blot 條帶的定量結果，**P < 0.01）

Figure 1 Overexpression of HPA in HUVEC cells (A: HPA protein level in HUVEC cells; B: Relative quantification of HPA protein in panel A,**< 0.01)

2.2 HPA 過表達對血管內皮細胞增殖的影響

在 HUVEC 細胞中轉染空載體或 HPA 表達質粒，并分別于不同時間點測定細胞活性。結果顯示，隨著細胞轉染后培養天數的增加，細胞活性逐漸增強，但 HPA 過表達后細胞的相對增殖率可達對照組的 2 ~ 3 倍（圖 2）。這說明過表達 HPA 可增加 HUVEC 細胞的增殖能力。

2.3 HPA 過表達對血管內皮細胞遷移的影響

在 HUVEC 細胞中轉染空載體或 HPA 表達質粒，48 h 后分別檢測細胞的遷移情況。結果顯示，HPA 過表達后穿膜細胞數高于對照組（圖 3A）。在顯微鏡下隨機選擇三個視野，計算兩組中遷移細胞的數量，并利用雙尾學生檢驗的方法進行統計學分析。結果顯示 HPA 轉染組的穿膜細胞數是對照組的 2 倍左右（圖 3B），這表明 HPA 過表達顯著促進了 HUVEC 細胞的遷移能力（α = 0.05，= 0.047）。

圖 2 HPA 過表達對 HUVEC 細胞增殖能力的影響

Figure 2 Effect of HPA overexpression on the proliferation of HUVEC cells

圖 3 HPA 過表達對 HUVEC 細胞遷移的影響（A：空載對照組和 HPA 轉染組 HUVEC 細胞遷移情況；B：3 個隨機視野下細胞遷移數的統計結果，*P < 0.05）

Figure 3 Effect of HPA overexpression on the migration of HUVEC cells (A: The migration of HUVEC cells transfected with or without HPA plasmid; B: The amounts of cells from three random selected fields,*< 0.05)

圖 4 HPA 過表達對 Tie2 和 Ang2 蛋白水平的影響（A：HEK293T 細胞中Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：A 圖 Western blot 條帶的定量結果；C：HUVEC 細胞中 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平；B：C 圖 Western blot 條帶的定量結果；*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 4 Effect of HPA overexpression on the levels of Tie2 and Ang2 in HEK293T and HUVEC cells (A: Tie2 and Ang2 protein levels in HEK293T cells; B: Relative quantification of each protein in panel A; C: Tie2 and Ang2 protein levels in HUVEC cells; D: Relative quantification of each protein in panel C;*< 0.05,**< 0.01)

2.4 HPA 過表達對血管活性分子表達的影響

分別在HEK293T 和 HUVEC 細胞中過表達 HPA，并檢測其對 Ang2 及 Tie2 蛋白表達的影響。結果顯示，在這兩種細胞中，HPA 轉染組細胞中內源 Tie2 和 Ang2 的蛋白水平均高于對照組（圖 4A 和 C）。經 Western blot 條帶的定量分析，顯示 HPA 轉染細胞后可使 Tie2 和 Ang2 蛋白表達量提高 1.5 以上（圖 4B和 D），這表明 HPA 過表達可促進細胞內血管活性分子 Tie2 和 Ang2 的表達。

3 討論

As 易損斑塊破裂是一個復雜的病理生理過程，病理性血管新生在 As 斑塊進展過程中起著重要作用。我們前期研究顯示，HPA 在As 斑塊內高表達，且可能促進斑塊內病理性血管新生過程，而目前關于 HPA 與新生血管的關系研究多集中于腫瘤學領域。因此，為了明確 HPA 在 As 斑塊內血管新生中的作用機制，本文從細胞和分子水平進一步研究了 HPA 基因對新生血管的影響。

本研究在對血管內皮細胞 HUVEC 的生物學行為進行了一系列研究后發現，HPA 過表達的血管內皮細胞具有較高的增殖率和穿膜能力，說明 HPA 與血管內皮細胞的增殖和轉移能力密切相關，這與其在促進腫瘤細胞的侵襲和轉移方面的功能很相似[21]，該結果揭示了 HPA 在血管新生中具有重要功能。

血管生成素家族及其酪氨酸激酶受體 Tie1 和 Tie2 可以連通內皮細胞和周圍間質，建立相對穩定的細胞生化作用[22]。Tie2 具有促進血管新生及維護血管的雙重作用。Ang1 和 Ang2 是 Tie2 特異性配體，它們可以分別激活或轉導內皮細胞 Tie2 信號。其中 Ang2 可以通過誘導平滑肌細胞/周細胞丟失來增加內皮細胞對促血管新生因子的敏感性，進而使新形成的血管系統不穩定。本研究發現，HPA 過表達可以促進 Ang2 和 Tie2 等血管活性因子的表達。這提示 HPA 還可能通過 Ang2/Tie2 通路參與調節 As 斑塊內的血管新生，但仍需要進一步設計實驗，如干擾細胞 Ang2 或 Tie2 情況下檢測 HPA 對血管新生的影響等來完善地證實這一結論。

綜上所述，本文從上調 HPA 基因表達水平角度出發，證明了HPA與血管內皮細胞的增殖和遷移能力密切相關，同時促進 Ang2 及 Tie2 血管活性分子的表達水平。硫酸甘露糖戊糖硫酸鹽（PI-88）可以競爭性抑制 HPA 表達，且動物模型已證實PI-88可抑制血管新生[23-24]。我們后續將利用 HPA 抑制劑 PI-88 從抑制 HPA 表達角度來進一步完善該工作。本部分工作將為探索 HPA 在 As 易損斑塊內血管新生過程中的作用機制提供重要的理論依據，同時對促進 As 治療的藥物新靶點的發現具有重要的指導意義。

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Effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line

WANG Jing, WU Chan, ZHOU Rui, CEN Shan, XU Bin

Author Affiliations: Department of Immunology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (WANG Jing, ZHOU Rui, CEN Shan); Department of Neurology (WU Chan, XU Bin), Fuxing Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

To explore the effects of HPA overexpression on the proliferation, invasion and vasoactive factors levels in HUVEC cell line and to further reveal the mechanism of HPA involved in the regulation of angiogenesis.

The expression plasmid of human HPA gene was constructed and transfected into HUVEV cells. The overexpression efficiency of the HPA plasmid was assessed by Western blot. Cell counting kit (CCK8) was performed to determine the cell growth and the transwell migration assay was performed to detect the cell migration. The effects of HPA overexpression on Ang2 and Tie2 protein were assessed by Western blot.

HPA expression was significantly upregulated in HUVEC cells transfected with the HPA expression plasmid. With the increase of days post-transfection, the relative cell growth rate in the HPA-transfected group was 2-3 folds more than that in the control group. Moreover, the transmembrane cell number and the protein levels of Ang2 and Tie2 were increased in HPA-transfected group.

HPA overexpressionpromotes HUVEC cell proliferation and migration and enhances the expression of Ang2 and Tie2, indicating that HPA may affect the angiogenesis in vulnerable plaques through regulating Ang2 and Tie2 expression.

Heparanase; Angiogenesis; Vasoactive factors

XU Bin, Email: xubincj1992@aliyun.com

北京市自然科學基金市教委科技計劃重點項目（KZ2015 10025031）

徐斌，Email：xubincj1992@aliyun.com

2018-02-27

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.004