應用2周齡ICR小鼠建立CVA16感染模型

王輝強，劉尚裕，李玉環

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應用2周齡ICR小鼠建立CVA16感染模型

王輝強，劉尚裕，李玉環

100050 北京，中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所病毒室

Enterovirus 71（EV71）和 coxsackievirus A16（CVA16）都屬于小核糖核酸病毒科的單正鏈 RNA 病毒，是引起手足口病的兩個主要病原體[1]。臨床上，這兩種病毒的感染通常是自限性的，小部分感染常與神經系統疾病相關，包括無菌性腦膜炎、腦干腦炎和急性弛緩性麻痹等[2]。手足口病已成為一個嚴重的公共衛生問題，在日本、馬來西亞、新加坡、越南、中國大陸等亞太地區存在周期性的爆發流行[3-5]。目前臨床上尚無有效的抗病毒藥物用于手足口病的預防和治療。

抗病毒藥物和疫苗的研發依賴于體內外篩選模型的建立，目前國內外CVA16 的動物模型主要是 1 周齡以內的乳鼠模型，但是利用 1 周齡以內的乳鼠進行抗病毒實驗操作難度較大，給藥途徑和給藥容量明顯受限，而且 1 周齡以內的乳鼠免疫系統發育尚不完善，在進行藥物體內藥效評價時有一定的局限性[6]。有研究報道，利用干擾素 α/β 和 γ 受體缺陷型小鼠（AG129）適應傳代獲得的 CVA16 毒株可以感染 12 周齡的 AG129 小鼠，但是該模型缺乏干擾素應答，對于通過調節先天免疫發揮抗 CVA16 作用的藥物無法評價其體內藥效，并且相對于常用的 ICR 等小鼠，AG129 小鼠的實驗成本會增加[7]。本實驗室通過將 CVA16 的臨床分離株在 ICR 乳鼠上的逐漸適應傳代成功建立了 2 周齡 ICR 小鼠的感染模型，采用細胞病變（CPE）法測定感染小鼠心、脾、肺、腎、小腸、腦和肌肉組織的 CVA16 病毒滴度，并利用 Western blot 方法檢測各組織中 CVA16 蛋白的表達。另外，利用該模型初步評價抗病毒藥物利巴韋林（RBV）的體內抗 CVA16 的藥效。該模型的建立可以更好地服務于抗 CVA16 藥物和疫苗的研發，也可進行 CVA16 發病機制的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 孕齡 17 ~ 18 d 的 ICR 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2012-0001]，待小鼠分娩后記錄乳鼠日齡，根據國家科學委員會設立的指導方針，按實驗動物使用的 3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞和病毒 Vero 細胞為本室自行傳代保存。CVA16（shzh05-1/GD/CHN/2005）由中國疾病預防控制中心提供，于 Vero 細胞中傳代，–80 ℃冰箱保存。細胞培養所用 MEM 培養基、胎牛血清及 PBS 均購自美國 Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒接種與傳代實驗方法 將 100 μl 的 CVA16 原液（大約 1 × 104TCID50）腹腔注射于 1 日齡 ICR 小鼠體內，9 d 后取后肢肌肉，經研磨得到組織研磨液后感染 Vero 細胞，待 90% 以上細胞出現細胞病變時收集病毒，于–80 ℃反復凍融 3 次后離心得到 CVA16-MA-I 毒種。將 CVA16-MA-I 毒種原液 100 μl 腹腔注射感染 6 日齡 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，經研磨得到組織研磨液后感染 Vero 細胞，收集得到 CVA16-MA-II 毒種。再將 CVA16-MA-II 毒種原液 100 μl 感染 12 日齡 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，經研磨得到組織研磨液后感染 Vero 細胞，收集得到 CVA16-MA-III 毒種。12 日齡 ICR 小鼠腹腔注射感染 CVA16-MA-III 毒種原液 100 μl，7 d 后取后肢肌肉，經研磨得到組織研磨液后感染 Vero 細胞，收集得到 CVA16-MA-IV 毒種。利用 CVA16-MA-IV 毒種原液 100 μl 感染 2 周齡 ICR 小鼠，7 d 后取后肢肌肉，經研磨得到組織研磨液后感染 Vero 細胞，收集得到 CVA16-MA-V毒種。

1.2.2 適應毒株 CVA16-MA-V 的 LD50測定 將 CVA16-MA-V 毒種以1 × 100、1 × 10-1、1 × 10-2、1 × 10-34 個稀釋度腹腔注射感染 2 周齡 ICR 小鼠，100 μl/只，觀察小鼠死亡情況，記錄死亡數并計算出 CVA16 對 2 周齡 ICR 小鼠的 LD50感染量，并作為后續實驗感染量的基礎。

1.2.3 小鼠組織中 CVA16 病毒滴度和病毒蛋白測定 將 CVA16-MA-V 毒種采用腹腔注射方式感染 2 周齡 ICR 小鼠（10 LD50），7 d 后采集小鼠心、脾、肺、腎、小腸、腦和肌肉組織，每種組織分兩份并稱重。將其中一份組織研磨得到的研磨液稀釋后，感染 Vero 細胞（細胞數 3 ×104/孔）進行病毒滴度測定，在 72 h 后觀察 CPE 并計算 TCID50。另一份組織采用動物組織蛋白提取試劑提取蛋白，采用 BCA 定量后進行 Western blot 檢測。一抗 CVA16 和 β-actin 均 4 ℃孵育過夜。

1.2.4 利巴韋林體內藥效評價 將 CVA16-MA-V 毒種10 LD50采用腹腔注射方式感染 2 周齡 ICR 小鼠（15 只），感染 1 h 后，用 50 mg/kg 的利巴韋林進行腹腔注射給藥，正常對照組和病毒對照組腹腔注射等量的生理鹽水，每天給藥 1 次，共 7 d。每組隨機選取 5 只小鼠，在末次給藥后采集后肢肌肉組織，進行病毒滴度測定和病毒蛋白檢測。另外 10 只小鼠觀察發病及死亡情況，共觀察 14 d。

1.2.5 病變（毒力）判定標準 根據臨床表現劃分 5 個等級：4 代表死亡；3 代表后肢癱瘓或垂死；2 代表后肢無力；1 代表毛發上豎散亂；0 代表正常。

1.3 統計學處理

采用 SPSS13.0 統計程序的卡方檢驗法比較存活率，并用 Kaplan-Meier 法比較平均生存時間。

2 結果

2.1 建立 2 周齡 CVA16 感染致死的 ICR 小鼠模型

首先，我們對適應傳代獲得的 CVA16-MA-V 毒種進行 LD50的測定，圖 1 結果顯示，不同稀釋度的 CVA16-MA-V毒種采用腹腔注射方式感染 2 周齡 ICR 小鼠后，1 × 100、1 × 10-1、1 × 10-2稀釋度的感染量小鼠全部死亡，而 1 × 10-3稀釋度的小鼠一半發生死亡，CVA16-MA-V 毒種的 LD50為 1 × 10-3稀釋度，經 Vero 細胞上病毒滴度檢測，CVA16-MA-V 毒種的 LD50約為 10 TCID50。

用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周齡的 ICR 小鼠，小鼠感染后逐漸出現毛發散亂、后肢無力、后肢癱瘓的癥狀。后肢麻痹無力在發病初期是發展較為緩慢的，在死亡前 1 ~ 2 d 后肢麻痹無力發展為后肢癱瘓。在整個感染過程中，小鼠的體重發生顯著的下降（圖 2A）。另外，原 CVA16 毒株不能有效感染 1 周齡以上的小鼠，對于 1 周齡以下的小鼠可以感染，但是不會出現死亡。CVA16-MA-V 毒株可以對 2 周齡以內的小鼠造成感染死亡，但是 3 周齡及以上的 ICR 小鼠腹腔注射 CVA16-MA-V 后沒有觀察到發病癥狀和死亡。

圖 1 CVA16-MA-V 感染 ICR 小鼠的劑量依賴性

2.2 CVA16-MA-V 在感染 ICR 小鼠中的組織分布

采用腹腔注射方式，用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周齡的 ICR 小鼠，在感染后 7 d，采集小鼠的心臟、脾臟、肺、腎、腦、腸以及后肢肌肉組織。將各組織研磨后的組織研磨液感染 Vero 細胞，采用 CPE 的方法檢測發現，在心臟、脾臟、腎臟、腸道和肌肉中均可檢測到病毒（圖 3A），且后肢肌肉中病毒載量最高。然而，在肺和大腦中沒有檢測到病毒。另外，用 Western blot 方法對各組織蛋白進行分析。結果如圖 3B 所示，在心臟、脾臟、腎臟、腸和肌肉中也檢測到 CVA16 蛋白表達，但在肺和大腦中均未檢測到病毒蛋白。

圖 2 利巴韋林對CVA16-MA-V 感染小鼠的抗病毒作用（A：小鼠感染9 d 內的體重；B：Western blot 檢測小鼠肌肉中CVA16 的蛋白表達；C：小鼠組織的病毒滴度；D：小鼠感染14 d 的存活率；與病毒對照組比較，**P < 0.05）

圖 3 CVA16 感染后 7 d 小鼠組織中的病毒載量（A：CPE 法；B：Western blot 法）

表 1 利巴韋林治療對 CVA16-MA-V 感染小鼠的體重（g）影響

時間（d）正常對照組病毒對照組利巴韋林組 27.38 ± 0.477.45 ± 0.377.04 ± 0.48 48.35 ± 0.368.08 ± 0.428.13 ± 0.42 68.89 ± 0.507.59 ± 0.39**8.37 ± 0.78# 810.92 ± 0.976.34 ± 0.42**8.03 ± 0.89#

注：n = 10；與正常對照組比較，**< 0.01；與病毒對照組比較，#< 0.05。

表 2 利巴韋林治療對 CVA16-MA-V 感染小鼠死亡比例和平均存活時間的影響

注：n = 10；與正常對照組比較，**< 0.01；與病毒對照組比較，##< 0.01。

圖 4 利巴韋林治療延緩 CVA16-MA-V 感染小鼠的發病過程（A：正常小鼠的臨床評分；B：病毒對照組感染小鼠的臨床評分；C：利巴韋林治療組小鼠的臨床評分）

2.3 利巴韋林抑制 CVA16 的體內復制，延緩發病過程

建立 2 周齡的 CVA16 感染模型后，我們進一步研究該模型的體內藥效評價適應性，明確該模型是否適合于抗 CVA16 的藥物體內藥效評價及機制研究。采用腹腔注射方式，用 10 LD50的 CVA16-MA-V 感染 2 周齡的 ICR 小鼠，利巴韋林治療組腹腔注射給藥 50 mg/kg，每天 1 次，連續 7 d。結果顯示，治療 7 d 的受感染小鼠肌肉組織中的 CVA16 病毒蛋白含量明顯減少（圖 2B）。此外，50 mg/kg 利巴韋林明顯降低感染小鼠后肢肌肉中的 CVA16 病毒滴度（圖 2C）。同時，我們也觀察到 50 mg/kg 的利巴韋林治療后，小鼠的體重減輕得到延緩（表1 和圖 2A），并增加了受感染小鼠的存活率（圖 2D）。病毒對照組小鼠的平均生存時間（MST）為（7.6 ± 1.1）d，而利巴韋林治療組的小鼠平均生存時間為（10.8 ± 2.8）d（表2），利巴韋林明顯延長小鼠的存活時間。圖 4 所示，病毒對照組小鼠出現毛發散亂、后肢無力、后肢癱瘓，8 d 內全部死亡，而利巴韋林可以延緩感染小鼠的發病過程，起到保護小鼠的作用。

3 討論

EV71 和 CVA16 是引起 5 歲以下兒童手足口病的兩大主要病原體，而手足口病的爆發嚴重影響了社會穩定。然而，目前尚無有效的藥物用于預防或治療手足口病[8]。缺乏合適的動物模型阻礙了抗手足口病藥物的研發。目前國內外已經有許多實驗室建立了 EV71 感染的不同模型，包括免疫缺陷小鼠和轉基因小鼠等，并用于候選藥物的體內藥效評價[9-12]。

在之前的研究中，我們使用 2 周齡的 BALB/c 小鼠建立了 EV71 感染的動物模型，并利用該模型評價了許多候選化合物的體內抗 EV71 的藥效[13]。此次我們通過逐代適應的方法，獲得可以感染 2 周齡 ICR 小鼠的 CVA16 適應株 CVA16-MA-V。CVA16-MA-V 感染 2 周齡的 ICR 小鼠可以引起肢體無力乃至癱瘓的癥狀，并且在眾多組織器官中均可以檢測到病毒，其中以肌肉中的病毒載量最高。利用該模型評價臨床用抗病毒藥物利巴韋林的體內抗 CVA16 藥效，結果顯示 50 mg/kg 的利巴韋林即可顯著減少小鼠肌肉中 CVA16 的病毒滴度和病毒蛋白表達，又提高了感染小鼠的存活率和平均存活時間。我們會在后續的研究工作中進一步開展 HE 染色或免疫組化等方法檢測藥物的體內藥效等研究，不斷完善該模型的體內藥效評價方法。綜上所述，我們建立的 2 周齡 ICR 小鼠的 CVA16 感染模型對現有的 CVA16動物模型是個很好的補充，可以促進我國抗 CVA16 藥物的研發及 CVA16 發病機制的研究。

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國家自然科學基金（81503118）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程（CAMS-I2M-1-010）；國家“重大新藥創制”科技重大專項（2018ZX09711003-005-004）

李玉環，Email：yuhuanlibj@126.com

2018-01-25

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.013