HPPCn調(diào)控HIF-2α促進(jìn)肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥

李春男，崔春萍

?

HPPCn調(diào)控HIF-2α促進(jìn)肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥

李春男，崔春萍

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)；102206 北京，軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所，國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（北京）

確定 HPPCn 調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF-2α）促使肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的機(jī)制。

利用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定和 Western blot 印跡檢測 mRNA 及蛋白水平表達(dá)。使用 MTS 測定來確定細(xì)胞存活率。細(xì)胞 transwell 和劃痕實驗被用來檢測細(xì)胞遷移和侵襲的能力。皮下異種移植小鼠模型模擬腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

缺氧誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥；HIF-2α 參與了缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥的發(fā)生；HPPCn 沉默通過抑制 HIF-2α 抑制缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥。

持續(xù)的索拉非尼治療產(chǎn)生的抗血管生成效應(yīng)會引起缺氧，誘導(dǎo)索拉非尼耐藥。HPPCn 或 HIF-2α 敲低聯(lián)合索拉非尼為治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌提供更有前景的治療策略。

癌，肝細(xì)胞； 缺氧誘導(dǎo)因子-2α； 索拉非尼； 肝細(xì)胞生成素 Cn

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）流行性廣、發(fā)病迅速、生存率低，居世界腫瘤相關(guān)死因的第二位。在全世界范圍內(nèi)，每年新診斷 HCC 患者的數(shù)量接近 100 萬，死亡人數(shù)超過 60 萬。我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，HCC 的發(fā)病率位居世界首位，占全球肝癌病例的50%以上[1]。

近年來，分子靶向藥物的發(fā)展為惡性腫瘤治療帶來了新的希望。在 HCC 靶向治療藥物研究中，索拉非尼通過靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體（VEGFR）信號和 Raf/MEK/ERK 信號發(fā)揮抗血管生成效應(yīng)，同時誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[2]，是首個獲得批準(zhǔn)的 HCC 多靶點靶向治療藥物，也是目前用于晚期 HCC 治療的一線藥物。然而，著名的SHARP 試驗，即索拉非尼與安慰劑對照治療晚期 HCC 的多中心、隨機(jī)、Ⅲ期臨床研究顯示，與安慰劑相比，索拉非尼對晚期 HCC 患者中位生存期的延長不超過 3 個月[3]。因此，如何抑制肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的發(fā)生，提高其治療效果，逐漸成為近年來人們關(guān)注的熱點。

缺氧微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞發(fā)生多藥耐藥的重要機(jī)制之一。索拉非尼通過阻斷 VEGF 信號，抑制腫瘤血管生成，進(jìn)一步加劇了腫瘤內(nèi)部缺氧[4-5]，這可能是肝癌細(xì)胞對索拉非尼產(chǎn)生耐藥，進(jìn)而影響其療效的重要原因。缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）是細(xì)胞在缺氧條件下表達(dá)的一個重要效應(yīng)分子，多年的研究證實，HIF-α（HIF-1α，HIF-2α 和 HIF-3α）作為 HIF 蛋白的調(diào)節(jié)和活性亞基，在多種腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及耐藥中發(fā)揮重要作用。在氧分壓正常條件下，脯氨酸羥基化酶（PHDs）使 HIF-α 羥基化。泛素連接酶 Von Hipple-Lindaup（VHL）能夠特異性識別并與羥基化的 HIF-α 結(jié)合，通過泛素化途徑使其降解。在缺氧條件下，一方面 HIF-α 的羥基化被阻止，另一方面 VHL 表達(dá)及活性受到抑制，致使HIF-α 在細(xì)胞內(nèi)過度積累。積累的 HIF-α 進(jìn)入細(xì)胞核，與 HIF-β 形成異源二聚體，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，并最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。到目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn) HIF 有 100 種以上的靶基因，如血管內(nèi)皮生長因子 VEGF，血小板衍生生長因子 PDGF，促紅細(xì)胞生成素 EPO，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體 GLUT-1 和 GLUT-3 等，它們在生長、代謝以及運(yùn)動等細(xì)胞生命活動的各個方面發(fā)揮作用[6-8]。

HIF 信號參與腫瘤耐藥機(jī)制的研究一直是人們研究的熱點，Chang 等[4]在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，持續(xù)索拉非尼用藥能夠增加腫瘤內(nèi)部缺氧，且索拉非尼耐藥的 HCC 組織中 HIF-1α 的表達(dá)顯著高于索拉非尼敏感的 HCC 組織。EF24，一種姜黃素類似物，能夠通過上調(diào) VHL 表達(dá)，促進(jìn) HIF-1α 泛素化降解，協(xié)同增加索拉非尼的抗癌效果[9]。HIF-2α（也稱為 EPAS1）作為 HIF-α 家族的重要成員之一，與 HIF-1α 有 48% 的同源氨基酸序列，分子結(jié)構(gòu)相似。目前的觀點認(rèn)為 HIF-1α 與 HIF-2α 分別在組織缺氧的不同時期發(fā)揮作用，而 HIF-2α 則在長期的慢性組織缺氧過程中扮演了更為重要的角色[10]。有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào) HIF-2α 表達(dá)能夠增強(qiáng)多柔比星對 HCC 的化療效果[11-12]。而最近的研究則認(rèn)為 HIF-2α 通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 TFDP3/E2F 途徑抑制了 HCC 的生長。因此，HIF-2α 參與肝癌多藥耐藥的作用和機(jī)制仍不清楚[10]。

肝細(xì)胞生成素 Cn（HPPCn）是一種從肝臟刺激物質(zhì)（HSS）中分離出來的肝臟生長因子，以往的研究顯示 HPPCn 與 HCC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13-16]。我們最近的研究表明HPPCn 在腫瘤的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化不良和血管侵襲呈顯著相關(guān)性[17]。此外，HPPCn 通過上調(diào) HCC 細(xì)胞中白血病髓樣細(xì)胞-1（Mcl-1）的表達(dá)抑制曲古霉素 A（TSA）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[18]。但 HPPCn 在索拉非尼耐藥中的作用尚未確定。本文主要提供 HIF-2α 參與 HCC 對索拉非尼耐藥性的證據(jù)，證明 HPPCn或 HIF-2α 沉默聯(lián)合索拉非尼代表 HCC 的有前景的治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和實驗動物 人 HCC 細(xì)胞系（SMMC7721、HepG2、HCC-LM3、HCC-97H、HCC-97L）訂購于上海細(xì)胞庫。5 ~ 6 周齡，雄性 BALB/c 裸鼠（D11-2050 和 D11-1004 2011）購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 SPF 級動物中心。所有動物手術(shù)均經(jīng)北京放射醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會和軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和器材 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 Hyclone@高糖 DMEM 粉末型培養(yǎng)基為美國 Life 公司產(chǎn)品；FBS 為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；胰蛋白酶-EDTA 消化液（0.25%）、RNA 抽提試劑均為美國 Invitrogen 公司產(chǎn)品；FBS 平衡鹽溶液為美國 Gibco 公司產(chǎn)品；抗體HIF-2α（NB100-122）為美國 Novus 公司產(chǎn)品；GAPDH（E-AB-20064）購自 Elabscience 公司；Transwell 小室購自美國 Costar 公司；Maxima H Minus 第一鏈 cDNA 合成試劑盒購自美國 Thermo 公司；青霉素、鏈霉素、無水乙醇、異丙醇、氯仿、Tris、EDTA 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。水套式二氧化碳培養(yǎng)箱和酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國 Thermo 公司；光學(xué)顯微鏡、倒置熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司；電子精密天平購自上海天平儀器廠；數(shù)顯恒溫三溫水浴鍋購自金壇市精達(dá)儀器制造廠；ABI 7500 FastTM實時定量 PCR 系統(tǒng)購自美國 Applied Biosystems 公司；ELISA 讀取器購自美國BioTek 公司。

1.2 方法

1.2.1 MTS 法測定細(xì)胞活力 根據(jù) MTS 測定試劑盒使用說明，評估細(xì)胞存活率。將 20 μl MTS 試劑加入到培養(yǎng)孔中并在 37 ℃下孵育 2 h 直至可見紫色沉淀。使用微孔板 ELISA 讀取器以分光光度法測量 490 nm 處的吸光度。

1.2.2 細(xì)胞遷移和侵襲測定 Transwell：配制含 5% 血清的 DMEN 培養(yǎng)基作為細(xì)胞誘導(dǎo)遷移液，24 孔板下層每孔加入遷移液 600 μl，將 transwell 小室嵌入其中；胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS 洗 2 遍，用無血清培養(yǎng)基懸浮，計數(shù) 1 × 105個細(xì)胞/100 μl，加入上層小室，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37 ℃、5% CO2，飽和水汽條件下培養(yǎng)，將上層小室取出，放置于 600 μl 4% 多聚甲醛中固定細(xì)胞 15 min；固定完成后，將上層小室放置于 0.1% 結(jié)晶紫溶液中染色5 ~ 10 min；取出上層小室后用棉簽輕拭未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下拍照計數(shù)。

劃痕實驗：細(xì)胞接種于 6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待生長至 90% 密度時用無菌槍頭劃痕，然后用 PBS 清洗細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，12 h 和 24 h 取出細(xì)胞觀察測量，結(jié)果由 Image J 分析。

1.2.3 Western blot 蛋白印跡 選取低氧培養(yǎng)不同時間點細(xì)胞，用 RIPA 裂解液裂解提取細(xì)胞總蛋白，加入蛋白 loading buffer 煮沸變性，根據(jù)目標(biāo)蛋白大小選取適宜膠濃度電泳，電泳完成后恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，一抗 4 ℃緩慢振蕩過夜，選擇對應(yīng)種屬二抗室溫封閉 1 h，顯影。

1.2.4 小鼠皮下異種移植模型 5 ~ 6 周齡，雄性 BALB/c 裸鼠，每組 10 只。在側(cè)腹皮下接種懸浮于 PBS 中的 5 × 106個 SMMC7721 細(xì)胞（用 lenti-shRNA 轉(zhuǎn)染或干擾）。索拉非尼甲苯磺酸酯用于體內(nèi)實驗。當(dāng)檢測到約 100 mm3的腫瘤（約 6 d）時，小鼠每天一次施用索拉非尼（口服，每周第1 ~ 5 天 10 mg/kg）。

1.2.5 體內(nèi)轉(zhuǎn)移分析 將 SMMC7721 細(xì)胞（1 × 106/0.1 ml）通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)以模擬腫瘤轉(zhuǎn)移。實驗動物（n = 10/組）從接種當(dāng)天開始每周接受 5 次索拉非尼 10 mg/(kg·d) 治療。接種 5 周后脫頸處死小鼠，取出器官組織并固定在甲醛中。

1.2.6 缺氧誘導(dǎo)處理 將貼壁細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液后放入低氧培養(yǎng)箱，條件設(shè)置為 37 ℃、5% CO2、1% O2培養(yǎng) 6、12、24、72 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用 Student's檢驗和雙向方差分析（ANOVA）和 Bonferroni's 校正，用平均 6 個標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）值進(jìn)行統(tǒng)計分析。< 0.05 表示具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 缺氧增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的索拉非尼耐藥

缺氧微環(huán)境與許多抗腫瘤藥物的耐藥性密切相關(guān)[12]。圖 1 中的數(shù)據(jù)表明，缺氧增加索拉非尼治療后不同 HCC 細(xì)胞系包括 HCC-LM3、HCC-97H、HCC-97L、SMMC7721 和HepG2 的細(xì)胞存活率。

細(xì)胞 transwell 和劃痕試驗結(jié)果表明，缺氧條件下 HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)（圖 2）。

2.2 HIF-2α 參與了缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥

如圖 2 所示，缺氧誘導(dǎo)后 SMMC7721 細(xì)胞存活率最高，因此我們選取 SMMC7721 進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)（6、12、24、72 h），發(fā)現(xiàn)缺氧條件下 SMMC7721 中 HIF-2α 水平顯著增加，VEGF 的 mRNA 表達(dá)增加（圖 3）。

為了研究 HIF-2α 在低氧介導(dǎo)的索拉非尼耐藥中的作用，將靶向 HIF-2α 的慢病毒介導(dǎo)的 shRNA（lenti-shRNA）感染 SMMC7721 細(xì)胞系。低氧條件下，lenti-shRNA 對照組（Scr）細(xì)胞中 HIF-2α 顯著高表達(dá)。相反在 HIF-2α 沉默（siHIF-2α）細(xì)胞中幾乎檢測不到（圖 4）。

圖 1 缺氧增加索拉非尼治療后不同 HCC 細(xì)胞系存活率（A：HepG2；B：SMMC7721；C：HCC-LM3；D：HCC-97H；E：HCC-97L）

Figure 1 Hypoxia increases cell viability after sorafenib treatment in different HCC cell lines (A: HepG2; B: SMMC7721; C: HCC-LM3; D: HCC-97H; E: HCC-97L)

圖 2 缺氧條件下 HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)

Figure 2 The migration and invasive ability of HCC cells was enhanced under hypoxia

圖 3 缺氧誘導(dǎo) SMMC7721 中 HIF-2α 水平顯著增加（A）和 VEGF mRNA 的表達(dá)增加（B）

Figure 3 Hypoxia induced a significant increase of HIF-2α (A) and increased expression of VEGF mRNA (B) in SMMC7721 cells

圖 4 靶向 HIF-2α 的慢病毒介導(dǎo)的 shRNA（lenti-shRNA）感染 SMMC7721 細(xì)胞系，有明顯的敲低效應(yīng)

Figure 4 Targeting lentivirus-targeting shRNA (lenti-shRNA) targeting HIF-2α to SMMC7721 cell line, a significant knockdown effect

接下來我們分析了HIF-2α 干涉對缺氧條件下肝癌細(xì)胞索拉非尼耐藥的影響。MTS Assay 結(jié)果顯示在常氧條件下，HIF-2α 敲低幾乎不影響細(xì)胞的存活，而在缺氧條件下，HIF-2α 敲低顯著抑制了缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥（圖 5），同時，我們利用劃痕和 transwell assay 檢測了HIF-2α 干涉對細(xì)胞遷移的影響，如圖6 和圖7 所示，缺氧培養(yǎng)能夠抵抗索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力降低，而HIF-2α 干涉則顯著抑制了這一效應(yīng)。

2.3 HIF-2α 敲低抑制低氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥和細(xì)胞遷移

為了檢測 HIF-2α 沉默和索拉非尼對腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移的療效，將轉(zhuǎn)染 lenti-shRNA 的SMMC7721細(xì)胞通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)以模擬腫瘤轉(zhuǎn)移。給予索拉非尼后，HIF-2α 沉默組和對照組平均每只小鼠病灶數(shù)減少 43.6% 和 19.1%（圖 8）。提示索拉非尼給藥后HIF-2α 沉默組小鼠較對照組更為敏感，HIF-2α 沉默抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。皮下實驗的結(jié)果顯示，索拉非尼在體內(nèi)抑制 HCC 細(xì)胞生長，相比于單獨使用，HIF-2α 沉默和索拉非尼的聯(lián)合使用可顯著抑制腫瘤生長。除此以外，我們利用肝癌細(xì)胞尾靜脈注射模型分析 HIF-2α 敲低對肝癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果如圖9 所示，索拉非尼給藥能抑制腫瘤細(xì)胞在肝臟、脾臟和小腸的轉(zhuǎn)移，而索拉非尼給藥聯(lián)合HIF-2α 敲低組很難檢測到GFP 熒光信號，提示HIF-2α 敲低能夠增加肝癌細(xì)胞對索拉非尼的敏感性。

圖 5 在 HIF-2α 敲低抑制低氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥和遷移

Figure 5 HIF-2α knockdown inhibits hypoxia-induced sorafenib resistance and migration

圖 6 HIF-2α 敲低抑制低氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥

Figure 6 HIF-2α knockdown inhibits hypoxia-induced sorafenib resistance

圖 7 HIF-2α 敲低抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移

Figure 7 HIF-2α knockdown inhibits hypoxia-induced cell migration

圖 8 HIF-2α 沉默抑制腫瘤的體內(nèi)生長

Figure 8 HIF-2α silencing inhibits tumor growth

2.4 HPPCn 敲低抑制缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥

HPPCn 是從 HSS 分離的肝生長因子。我們以前的工作表明，HPPCn 在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化不良和血管侵襲顯著相關(guān)[16-17]。MTS 結(jié)果顯示用重組人 HPPCn 處理以劑量依賴性方式抑制由索拉非尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并且在缺氧條件下于 HCC 細(xì)胞系中增強(qiáng)索拉非尼抗性（圖 10）。

1：Saline + Scr；2：Sorafenib + Scr；3：Saline + siHIF-2α；4：Sorafenib + siHIF-2α

Figure 9 HIF-2α silencing inhibits tumor metastasis(A: Liver; B: Spleen; C: Intestine; D: Quantitative map)

圖 10 rhHPPCn 促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥

Figure 10 rhHPPCn promotes sorafenib-resistance induced by hypoxia

圖 11 rhHPPCn 處理增加缺氧條件下 HCC 細(xì)胞中 HIF-2α 的積累（A，B）和 VEGF 的表達(dá)（A，C）

Figure 11 rhHPPCn treatment increases HIF-2α accumulation (A, B) and VEGF expression (A, C) in HCC cells under hypoxia

圖 12 HIF-2α 敲低部分阻斷低氧條件下 HPPCn 對索拉非尼耐藥的影響

Figure 12 HIF-2α knockdown partially blocks the effect of HPPCn on sorafenib resistance under hypoxic conditions

此外，rhHPPCn 處理增加缺氧條件下 HCC 細(xì)胞中 HIF-2α 的積累和 VEGF 的表達(dá)（圖11）。

然而，如圖 12 所示，rhHPPCn 對索拉非尼耐藥性的影響在 lenti-shRNA 沉默 HIF-2α的細(xì)胞中受到部分阻滯。在低氧條件下索拉非尼給藥后，相對于對照組的 66.5%，在 HIF-2α 沉默的 HCC 細(xì)胞中，細(xì)胞存活率降低至 37.8%。

圖 13 中，HCC 細(xì)胞系中 lenti-shRNA 靶向敲低 HPPCn 后，HPPCn 的蛋白表達(dá)水平降低了 79.3%。缺氧增加了對照細(xì)胞中 HPPCn 和 HIF-2α mRNA 和蛋白質(zhì)的水平，但是在 HPPCn 敲低的細(xì)胞中沒有。此外，低氧條件下 HPPCn 敲低可抑制 VEGF 表達(dá)。

MTS 結(jié)果顯示 HPPCn 敲低增強(qiáng)了細(xì)胞在缺氧條件下對索拉非尼的敏感性（圖 14）

3 討論

在大多數(shù)實體瘤中腫瘤缺氧微環(huán)境與腫瘤的發(fā)展、預(yù)后和轉(zhuǎn)移，以及治療效果密切相關(guān)，而對這一領(lǐng)域的研究已經(jīng)成為尋找癌癥新治療方法的熱點。最近研究表明，HIF 亞型調(diào)節(jié)不同的基因表達(dá)，其不同之處正在不斷被人們發(fā)現(xiàn)[3, 6]。HIF-1α 與HIF-2α 在很多人腫瘤組織中表達(dá)，但兩者的表達(dá)有一定差異。在腫瘤組織以及非腫瘤組織中氧分壓較高的條件下，HIF-2α 均比 HIF-1α 更能穩(wěn)定表達(dá)。另外，與 HIF-1α 不同，HIF-2α 僅能在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，包括肝細(xì)胞。在肝細(xì)胞肝癌中，盡管兩者都呈陽性表達(dá)，HIF-2α 與患者的預(yù)后關(guān)系更加密切。因此，我們通過檢測 HCC 患者腫瘤樣本中基因的表達(dá)研究其在臨床的重要意義，利用過表達(dá)和敲低 HIF-2α 實驗以研究其作用機(jī)制。本研究首次證實，在人類 HCC 患者和小鼠模型中持續(xù)的索拉非尼治療產(chǎn)生的抗血管生成效應(yīng)會引起缺氧，作為一種細(xì)胞保護(hù)適應(yīng)性反應(yīng)誘導(dǎo)出了索拉非尼耐藥，因此限制了索拉非尼的效力。低劑量索拉非尼治療，在早期階段會適度抑制腫瘤生長。在皮下和原位腫瘤成瘤模型中，伴隨腫瘤內(nèi)缺氧的發(fā)生腫瘤會持續(xù)快速增長，這些現(xiàn)象表明缺氧可以促進(jìn)肝癌的索拉非尼耐藥。

圖 13 HPPCn 敲低抑制了 HIF-2α 和 VEGF 的 mRNA 水平表達(dá)

Figure 13 HPPCn knockdown inhibited the expression of HIF-2α and VEGF

圖 14 HPPCn 敲低抑制缺氧誘導(dǎo)的索拉非尼耐藥性

Figure 14 HPPCn knockdown suppresses hypoxia-induced sorafenib resistance

在本研究中，我們假設(shè)由索拉非尼的抗血管生成作用誘導(dǎo)的腫瘤缺氧以及細(xì)胞對于氧和營養(yǎng)缺乏的高度耐受可能是在 HCC 中持續(xù)索拉非尼治療產(chǎn)生耐藥性的潛在機(jī)制。研究HPPCn 及 HIF-2α 表達(dá)與索拉非尼耐藥發(fā)生的相關(guān)性，并揭示其相互調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而評價 HPPCn 以及 HIF-2α 作為肝癌治療靶點、協(xié)同增強(qiáng)索拉非尼治療效果的作用。該研究可能為提出新的 HCC 治療策略提供線索。

[1] Chan SL, Wong VW, Qin S, et al. Infection and cancer: The case of hepatitis B. J Clin Oncol, 2016, 34(1):83-90.

[2] Cervello M, McCubreyJA, Cusimano A, et al. Targeted therapy for hepatocellular carcinoma: novel agents on the horizon. Oncotarget, 2013, 3(3):236-260.

[3] Llovet JM, Ricci S, Mazzaferro V, et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma. N Engl J Med, 2008, 359(4):378-390.

[4] Chang YS, Adnane J, Trail PA, et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol, 2007, 59(5):561-574.

[5] Zhai B, Sun XY. Mechanisms of resistance to sorafenib and the corresponding strategies in hepatocellular carcinoma. World J Hepatol, 2013, 5(7):345-352.

[6] Semenza GL. HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing. Curr Opin Cell Biol, 2001, 13(2):167-171.

[7] Rankin EB, Giaccia AJ. The role of hypoxia-inducible factors in tumorigenesis. Cell Death Differ, 2008, 15(4):678-685.

[8] Menrad H, Werno C, Schmid T, et al. Roles of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) versus HIF-2alpha in the survival of hepatocellular tumor spheroids. Hepatology, 2010, 51(6):2183-2192.

[9] Liang Y, Zheng T, Song R, et al. Hypoxia-mediated sorafenib resistance can be overcome by EF24 through von hippel-lindau tumor suppressor-dependent HIF-1α inhibition in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2013, 57(5):1847-1857.

[10] Koh MY, Powis G. Passing the baton: the HIF switch. Trends in Biochemical Sciences, 2012, 37(9):364-372.

[11] He C, Sun X, Qiao H, et al. Downregulating hypoxia-inducible factor-2α improves the efficacy of doxorubicin in the treatment of hepatocellular carcinoma. Cancer Sci, 2012, 103(3):528-534.

[12] Rankin EB, Rha J, Unger TL, et al. Hypoxia-inducible factor-2 regulates vascular tumorigenesis in mice. Oncogene, 2008, 27(40): 5354-5358.

[13] Cui CP, Zhang DJ, Shi BX, et al. Isolation and functional identification of a novel human hepatic growth factor: hepatopoietin Cn. Hepatology, 2008, 47(3):986-995.

[14] Cui CP, Wei P, Liu Y, et al. Protective role of hepatopoietin Cn on liver injury induced by CCl4/ethanol in rat. Hepatol Res, 2009, 39(2):200-206.

[15] Liu Y, Li XL, Zhang DD, et al. Production of hepatopoietin Cn in high-cell-density cultures of recombinant escherichia coli and detection of its antioxygen activity. Mol Biotechnol, 2011, 47(1):161- 166.

[16] Liu Y, Saiyan S, Men TY, et al. Hepatopoietin Cn reduces ethanol-induced hepatoxicity via sphingosine kinase 1 and sphingosine 1-phosphate receptors. J Pathol, 2013, 230(4):365-376.

[17] Zhu BD, Li XL, Liu Y, et al. Involvement of hepatopoietin Cn in the development of human hepatocellular carcinoma. Clin Exp Metastasis, 2010, 27(4):571-580.

[18] Chang J, Liu Y, Zhang DD, et al. Hepatopoietin Cn suppresses apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells by up-regulating myeloid cell leukemia-1. World J Gastroenterol, 2010, 16(2):193-200.

HPPCn regulates HIF-2α-promoting sorafenib resistance in hepatoma cells

LI Chun-nan, CUI Chun-ping

Author Affiliations: Anhui Medical University, Hefei 230032, China; State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Beijing 102206, China

To determine the mechanism of HPPCn promoting sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma by accumulating hypoxia inducible factor-2α (HIF-2α).

Real-time polymerase chain reaction and Western blot were used to detect mRNA and protein expression. MTS assays were used to determine cell viability. Cell transwell and scratch assays were used to test cell migration and invasion ability. Subcutaneous xenograft mouse models were used to model tumor metastasis.

HIF-2α was involved in hypoxia-mediated sorafenib resistance; HIF-2α silence enhanced inhibition of cell migration of sorafenib under hypoxia in HCC; HPPCn promoted hypoxia-mediated sorafenib resistence by HIF-2α acuumulation; HPPCn shRNA overcome hypoxia-mediated sorafenib resisitence by inhibiting HIF-2α accumulation in HCC.

The anti-angiogenic effect of sustained sorafenib treatment induces hypoxia and sorafenib resistance. HPPCn or HIF-2α shRNA combined with sorafenib provides more promising therapeutic strategies for the treatment of HCC.

Carcinoma, hepatocellular; Hypoxia-inducible factor 2; Sorafenib; Hepatopoietin Cn

CUI Chun-ping, Email: cui_chunping2000@aliyun.com

崔春萍，Email：cui_chunping2000@aliyun.com

2018-02-25

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.010