力學(xué)刺激對體外保存軟骨活力影響的實(shí)驗(yàn)研究

曲鵬瑋，亓建洪，韓運(yùn)寧，周路，謝地，張凱紅，畢懿康

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力學(xué)刺激對體外保存軟骨活力影響的實(shí)驗(yàn)研究

曲鵬瑋，亓建洪，韓運(yùn)寧，周路，謝地，張凱紅，畢懿康

271016 泰安，泰山醫(yī)學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)研究所

對體外保存豬膝關(guān)節(jié)軟骨施加滾壓力學(xué)刺激，探究力學(xué)刺激對軟骨組織活力的影響。

利用滾壓力學(xué)加載裝置可以為骨軟骨組織提供含有組織培養(yǎng)液的環(huán)境，并進(jìn)行仿生的力學(xué)刺激。用骨軟骨取材器械體外無菌獲取豬膝關(guān)節(jié)軟骨，于培養(yǎng)液保存過程中施加力學(xué)刺激（1.5 和4.0 MPa）后在第 2 周檢測軟骨的細(xì)胞存活率、蛋白多糖表達(dá)、組織形態(tài)學(xué)、楊氏模量。

1.5 MPa 組顯示最高的軟骨細(xì)胞存活率、蛋白多糖含量與楊氏模量，組織形態(tài)表現(xiàn)良好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）；與靜態(tài)對照組相比，4.0 MPa 組上述指標(biāo)下降（< 0.05），形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較差。

對體外保存軟骨施加適宜的滾壓力學(xué)刺激，能在2 周時間提高軟骨細(xì)胞存活率，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，并提升生物力學(xué)性能，為組織庫軟骨保存技術(shù)提供一種新方法。

軟骨，關(guān)節(jié)； 細(xì)胞外基質(zhì)； 力學(xué)刺激； 體外保存

關(guān)節(jié)軟骨是一種柔軟的結(jié)締組織，在滑膜組織中能減少摩擦、緩沖壓力、保護(hù)軟骨下骨，并且能傳遞力學(xué)信號[1]。軟骨組織無血管，自我修復(fù)力差。同種異體骨軟骨移植（osteochondral allografts，OCAs）沒有供區(qū)二次手術(shù)創(chuàng)傷，能用于修復(fù)大面積軟骨損傷，遠(yuǎn)期臨床療效較為理想[2]。骨軟骨組織移植前需要進(jìn)行大約 2 周的微生物檢測過程，在組織培養(yǎng)保存過程中，軟骨細(xì)胞活性隨時間而降低。提高移植軟骨細(xì)胞活力、延長有效保存時間成為研究的難題和熱點(diǎn)，研究主要集中在優(yōu)化培養(yǎng)液成分、探索保存溫度等方面[3]。人體關(guān)節(jié)軟骨承受著持續(xù)的力學(xué)載荷。生物力學(xué)在軟骨的發(fā)育、病理生理過程發(fā)揮十分重要的作用，力學(xué)載荷通過復(fù)雜的方式調(diào)控軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的代謝活動[4]。流體靜壓力、軸向壓縮等力學(xué)形式都已不同程度地應(yīng)用于壓力相關(guān)的軟骨細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)研究，旨在促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化與細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)[5]。本研究利用課題組研制的模擬膝關(guān)節(jié)生理運(yùn)動的滾壓力學(xué)加載裝置，對體外保存關(guān)節(jié)軟骨施加不同水平的滾壓力學(xué)刺激，通過對軟骨細(xì)胞存活率、基質(zhì)含量、力學(xué)性能等評估，探究力學(xué)刺激對體外保存軟骨組織活力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

健康六月齡、體重 100 kg 豬的新鮮后肢購自泰安市屠宰場；DMEM 培養(yǎng)液購自美國 Gibco 公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、蘇木素、伊紅購自美國 Solarbio 公司；番紅 O、二乙酸熒光素（FDA）、溴化乙錠（EB）購自美國 Sigma 公司；骨軟骨移植器械為美國 Arthrex 公司產(chǎn)品；3343 型力學(xué)測試儀為美國 Instron 公司產(chǎn)品；Eclipse-80I 型光學(xué)/熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；VT1000 型振蕩切片機(jī)、RM2235 型切片機(jī)為德國 Leica 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 骨軟骨組織獲取 遵照無菌手術(shù)原則對豬膝關(guān)節(jié)皮膚用碘伏消毒，確保關(guān)節(jié)囊完整，鋪洞巾。用外科解剖刀行膝關(guān)節(jié)正中切口，離斷髕韌帶、前后交叉韌帶，完全暴露關(guān)節(jié)面。用專用手術(shù)器械獲取股骨髁負(fù)重區(qū)直徑為 8 mm，長為 10 mm 的帶有軟骨下骨的骨軟骨標(biāo)本 90 枚，取材中給予軟骨 PBS 沖洗保持濕潤，之后將骨軟骨底面修平，PBS 沖洗去除殘余脂肪與骨髓組織，放入無菌器皿中備用。

1.2.2 力學(xué)刺激與分組 利用課題組研制的滾壓力學(xué)加載裝置對軟骨組織進(jìn)行力學(xué)刺激，該裝置已獲得實(shí)用新型專利。裝置包括調(diào)速電機(jī)、傳動輪、摩擦架、滾筒等。其工作原理是：在無菌條件下將軟骨組織塊放在含組織液的裝置內(nèi)，通過調(diào)速電機(jī)帶動傳動輪、摩擦架在軟骨組織塊上做往返運(yùn)動，同時底部滾筒旋轉(zhuǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對軟骨組織塊施加滾壓力學(xué)載荷。根據(jù)前期研究，本次實(shí)驗(yàn)分 3 組，每組 30 個標(biāo)本，A 組為靜態(tài)對照組，在 DMEM 培養(yǎng)液中靜態(tài)保存，B 組為 1.5 MPa 組，C 組為 4.0 MPa 組，B 組和 C 組軟骨在 DMEM 培養(yǎng)液保存，第 1、7 天將軟骨置于加載裝置內(nèi)并施加滾壓力學(xué)刺激，每次 30 min，3 個組均隔天更換 DMEM 培養(yǎng)液，在第 14 天檢測軟骨相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3 觀察與檢測

1.2.3.1 軟骨細(xì)胞存活率 去除標(biāo)本的軟骨下骨，保留軟骨，PBS 沖洗，使用振蕩切片機(jī)垂直于軟骨表面，將軟骨組織行厚度 30 μm 切片，置于 EP 管內(nèi)，滴加 5 mg/L 的 FDA 和 50 mg/L 的 EB 各 500 μl，混勻后放入恒溫箱，37 ℃避光孵育 15 min，洗后從 EP 管中取出平鋪于載玻片上，使用熒光顯微鏡在 450 nm 波長激發(fā)光下進(jìn)行觀察。FDA/EB 熒光染色后，胞膜完好的活細(xì)胞顯綠色，死細(xì)胞顯紅色；100 倍視野下隨機(jī)選擇拍照，用 Image J 軟件對圖像內(nèi)的綠、紅色細(xì)胞計數(shù)并計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）= 活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù) × 100%

1.2.3.2 番紅 O 染色 4% 多聚甲醛固定骨軟骨 24 h，然后流水沖洗，置入 10% EDTA中脫鈣2 周。梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，行 5 μm 厚度石蠟切片。脫蠟，梯度酒精水化，0.001% 固綠染色 5 min，鹽酸酒精分化 10 s，0.1% 番紅 O 染色 10 min。梯度脫水，透明，封片并鏡檢。在40 倍視野下拍照，使用 Image-Pro Plus 軟件分析番紅染色的積分光密度值（）。

1.2.3.3 HE 染色 石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色 10 min，自來水洗，碳酸鋰飽和溶液復(fù)藍(lán)數(shù)秒，伊紅染色 3 min，水洗，梯度酒精脫水，透明，封片并鏡檢。

1.2.3.4 楊氏模量檢測 使用英斯特朗力學(xué)測試機(jī)來檢測軟骨楊氏模量。去除軟骨下骨，將直徑 8 mm，厚度 2 mm 的軟骨置于壓力臺，調(diào)節(jié)壓力臺至剛好不觸及軟骨。進(jìn)行預(yù)調(diào)試，使軟骨固有的粘彈性達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)。設(shè)置加載速度 5 mm/min，保護(hù)壓力 200 N，最大壓縮量 40%，進(jìn)行軸向加載實(shí)驗(yàn)，測定應(yīng)力與應(yīng)變，由系統(tǒng)自動采集數(shù)據(jù)，并計算樣本在壓縮量為 15% 時的楊氏模量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞存活率檢測

軟骨 FDA/EB 熒光染色結(jié)果，綠色表示軟骨活細(xì)胞，橙色或紅色表示死細(xì)胞。1.5 MPa 組顯示最高的綠色細(xì)胞比例，靜態(tài)組顯示較多的紅色細(xì)胞，4.0 MPa 組紅色細(xì)胞比例更高（圖 1）。圖像處理軟件分析細(xì)胞組成比例顯示，1.5 MPa 組細(xì)胞存活率高于靜態(tài)對照組和 4.0 MPa 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）；4.0 MPa 組細(xì)胞存活率低于靜態(tài)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）（表 1）。

2.2 軟骨番紅 O-固綠染色觀察

番紅 O 與嗜堿性軟骨結(jié)合顯紅色，反映基質(zhì)中蛋白多糖分布。1.5 MPa 組全層著色好，其中深層最明顯，證明蛋白多糖含量高；靜態(tài)對照組著色較好，淺層淡染較明顯；4.0 MPa 組基質(zhì)整體淡染，深層也較明顯（圖 2）。軟件分析（表 1）顯示，1.5 MPa 組的值高于靜態(tài)組和 4.0 MPa 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）；4.0 MPa 組的值低于其他兩組，蛋白多糖成分較多流失，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.05）。

圖 1 軟骨細(xì)胞 FDA/EB 熒光染色（× 100）（A：靜態(tài)對照組；B：1.5 MPa 組；C：4.0 MPa 組）

Figure 1 FDA/EB fluorescent staining of chondrocytes (× 100) (A: Static control group; B: 1.5 MPa group; C: 4.0 MPa group)

表 1 軟骨細(xì)胞存活率及軟骨番紅O 染色I(xiàn)OD值（，n = 10）

注：a與靜態(tài)對照組比較，< 0.05；b與1.5 MPa 組比較，< 0.05。

Notes:a< 0.05 versus static control group;< 0.05 versus 1.5 MPa group.

圖 2 軟骨基質(zhì)番紅 O 染色（× 40）（A：靜態(tài)對照組；B：1.5 MPa 組；C：4.0 MPa 組）

Figure 2 Safranin-O staining of cartilage matrix (× 40) (A: Static control group; B: 1.5 MPa group; C: 4.0 MPa group)

圖 3 軟骨 HE 染色觀察（× 40）（A：靜態(tài)對照組；B：1.5 MPa 組；C：4.0 MPa 組）

Figure 3 HE staining of cartilage tissues (× 40) (A: Static control group; B: 1.5 MPa group; C: 4.0 MPa group)

2.3 HE 染色結(jié)果

1.5 MPa 組軟骨層次分明，表面平整，基質(zhì)含量豐富，細(xì)胞數(shù)量正常，淺層細(xì)胞多為扁平樣，體積較小，深層軟骨細(xì)胞體積較大，位于透明狀陷窩內(nèi)，潮線完整；靜態(tài)對照組軟骨表面光滑，淺層細(xì)胞數(shù)下降，基質(zhì)著色稍淡，潮線完整；4.0 MPa 組軟骨表面粗糙，基質(zhì)淡染較明顯，軟骨與下骨出現(xiàn)分離（圖 3）。

2.4 軟骨楊氏模量檢測

軟骨的負(fù)重能力可以通過檢測楊氏模量來反映。當(dāng)壓縮率為 15% 時，第 14 天靜態(tài)對照組軟骨的楊氏模量為（6.78 ± 0.27）MPa，1.5 MPa 組軟骨楊氏模量為（7.64 ± 0.35）MPa，4.0 MPa 組軟骨楊氏模量為（6.27 ± 0.30）MPa，三組之間差異有顯著性意義（= 71.25，< 0.001）；LSD 檢驗(yàn)結(jié)果，1.5 MPa 組楊氏模量高于靜態(tài)對照組和 4.0 MPa 組，4.0 MPa 組低于靜態(tài)對照組，有顯著性差異（< 0.05）（圖 4）。

圖 4 軟骨楊氏模量檢測（與靜態(tài)對照組相比，*P < 0.05）

Figure 4 Young's modulus of cartilage tissues (*< 0.05 versus static control group)

3 討論

同種異體骨軟骨移植（OCAs）常用于治療復(fù)雜的大范圍軟骨損傷，應(yīng)用于運(yùn)動員軟骨損傷也取得較滿意療效[6]。要將這項(xiàng)技術(shù)全面推廣，還需解決軟骨供體問題和軟骨組織體外保存技術(shù)問題。目前保存異體骨軟骨組織更多采用組織培養(yǎng)法。在保存過程中，組織脫離了力學(xué)刺激，軟骨組織活力不斷降低。本實(shí)驗(yàn)嘗試將力學(xué)干預(yù)應(yīng)用于軟骨體外保存過程中。

在生理狀況下，關(guān)節(jié)軟骨受到周期性的力學(xué)載荷刺激，力學(xué)作用形式包括流體靜壓力、剪切力、張力等，通過較為復(fù)雜的方式調(diào)控軟骨細(xì)胞遷移、分化等代謝活動。力學(xué)刺激對維持軟骨功能至關(guān)重要，但是負(fù)荷過多或不足都會帶來有害影響，導(dǎo)致軟骨退變。軟骨組織工程中可通過對干細(xì)胞施加力學(xué)載荷而促進(jìn)軟骨化進(jìn)程[7]。對于軟骨細(xì)胞表型與基質(zhì)代謝的維持，適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激可產(chǎn)生正向影響，例如促進(jìn) SOX9 等軟骨形成因子與基質(zhì)成分表達(dá)[8-9]，而不適宜的力學(xué)形式也可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型失衡[10]。本實(shí)驗(yàn)從軟骨組織層次施加力學(xué)刺激探索其作用。人體膝關(guān)節(jié)內(nèi) 3 ~ 5 MPa 的壓力水平是常見的，正常行走時，膝關(guān)節(jié)內(nèi)同時存在滾動與滑動，滾壓載荷是活動狀態(tài)下的正常力學(xué)載荷[11]。我們設(shè)計了模擬生理的滾壓力學(xué)加載裝置，提供軸向壓縮力與剪切力的復(fù)合形式，在含有培養(yǎng)液的環(huán)境下，對體外保存的游離關(guān)節(jié)軟骨給予一定的滾壓力學(xué)刺激。有研究報道，對軟骨細(xì)胞施加間歇性流體靜壓力（0.3 MPa，6 h/d）并培養(yǎng) 7 d，促進(jìn)了蛋白多糖與 II 型膠原合成[12]。也有研究報道，對軟骨細(xì)胞每 3 天施加一次拉伸力，每次30 min，第6 天較靜態(tài)組出現(xiàn)明顯的軟骨細(xì)胞增殖，第 4 周促進(jìn)了蛋白多糖合成，而施加拉伸力的頻率為每天 1 次，則細(xì)胞輕微增殖，第 4 周未出現(xiàn)明顯的基質(zhì)成分提升，說明選擇合適的刺激頻率是重要的[13]。前期我們進(jìn)行正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.5 MPa 的壓力值能短時間內(nèi)提高軟骨的力學(xué)性能，本次設(shè)置了 1.5 MPa 與高壓力水平 4.0 MPa，并從軟骨活性方面進(jìn)行研究。為了減小軟骨染菌的可能，我們在第 1、7 天兩個時間點(diǎn)進(jìn)行每次 30 min 的力學(xué)干預(yù)，形成間歇性加載保存，觀察應(yīng)力刺激對軟骨組織的影響。

通常用軟骨細(xì)胞存活率來評價體外保存效果，細(xì)胞活性也作為衡量軟骨移植修復(fù)效果的重要指標(biāo)。研究顯示，對軟骨細(xì)胞施加壓力（50% 強(qiáng)度，3 h/d）在第 1 天維持了較高的軟骨細(xì)胞活力，2 周時間提高了 II 型膠原與蛋白聚糖的表達(dá)[14]。對軟骨細(xì)胞施加頻率為 2 Hz 與 3 Hz 的軸向壓力（10%強(qiáng)度，24 h），促進(jìn)了軟骨細(xì)胞增殖，頻率為 1 Hz時提高了蛋白多糖表達(dá)并維持了 7 d[15]。本實(shí)驗(yàn)第 14 天檢測結(jié)果，1.5 MPa 組細(xì)胞存活率比靜態(tài)保存組高，適宜的滾壓力學(xué)刺激提升了軟骨細(xì)胞活力，而4.0 MPa 組細(xì)胞存活率比靜態(tài)組低，證明了 4.0 MPa 的應(yīng)力水平為有害的力學(xué)形式，對軟骨細(xì)胞產(chǎn)生破壞性作用。軟骨中細(xì)胞比例為 1% ~ 5%，能合成蛋白多糖等基質(zhì)成分。蛋白多糖積分光密度檢測顯示，1.5 MPa 組蛋白多糖表達(dá)高于靜態(tài)組和 4.0 MPa 組，促進(jìn)了基質(zhì)表達(dá)，而 4.0 MPa 組蛋白多糖成分低于對照組，出現(xiàn)較大退化，4.0 MPa 為有害的載荷刺激，與細(xì)胞活性呈一致的趨勢。HE 染色提示 1.5 MPa 組呈現(xiàn)較好的組織形態(tài)特點(diǎn)，細(xì)胞數(shù)目多，基質(zhì)異染性較好，而 4.0 MPa 組基質(zhì)淡染，骨與軟骨連接疏松出現(xiàn)分離，提示發(fā)生損傷。關(guān)于力學(xué)影響軟骨細(xì)胞的機(jī)制尚未完全闡明，研究報道力學(xué)刺激增加細(xì)胞內(nèi) Ca2+聚集，通過提高離子交換活動以及激活機(jī)械敏感通道，導(dǎo)致三磷酸肌醇等中間信號分子的產(chǎn)生而引起激酶級聯(lián)反應(yīng)[16]，也有研究顯示力學(xué)載荷激活了 MAPKs 信號通路而增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖[17]。

生物力學(xué)檢測是反映關(guān)節(jié)軟骨承載能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)，承載作用主要表現(xiàn)為抗壓力和抗拉力，其中以抗壓力顯得尤為重要[18]。關(guān)節(jié)軟骨呈粘彈性，楊氏模量可反映軟骨的抗壓性能。1.5 MPa 組的楊氏模量最高，呈現(xiàn)較好的生物力學(xué)性能，與力學(xué)刺激引起的基質(zhì)上調(diào)密不可分。而 4.0 MPa 組軟骨力學(xué)性能下降，驗(yàn)證了 4.0 MPa 為過大負(fù)荷。動物實(shí)驗(yàn)中常采取摘除半月板、切斷交叉韌帶等方式，可造成軟骨受壓過大而出現(xiàn)力學(xué)性能下降、骨性關(guān)節(jié)炎等表現(xiàn)，生理狀況下適當(dāng)?shù)牧W(xué)載荷才是有利的。

本實(shí)驗(yàn)對體外保存軟骨在含組織培養(yǎng)液的環(huán)境中給予 1.5 MPa 適宜的滾壓力學(xué)刺激，在 2 周的時間內(nèi)提高了軟骨細(xì)胞活力，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，提升了生物力學(xué)性能。為組織庫軟骨保存提供了一種新思路，旨在提高軟骨組織庫利用率和關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)的不足之處是未進(jìn)行力學(xué)刺激對軟骨組織正向作用的機(jī)制探索。力學(xué)刺激方案（大小、時間等）的不斷優(yōu)化來提升正向作用的持續(xù)時間并探索相關(guān)機(jī)制是今后研究的重點(diǎn)。

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Effects of mechanical stimulation on viability of cartilage preserved

QU Peng-wei, QI Jian-hong, HAN Yun-ning, ZHOU Lu, XIE Di, ZHANG Kai-hong, BI Yi-kang

Author Affiliation: Institute of Sports Medicine, Taishan Medical University, Taian 271016, China

To investigate the effects of mechanical stimulation on chondrocyte viability, by exerting rolling-sliding mechanical stimulation on the porcine articular cartilage preserved.

The rolling-sliding mechanical device used could provide an environment for osteochondral tissue containing culture medium, and applied bionic mechanical stimulation. The cartilage of porcine knee was obtainedunder sterile condition by a special osteochondral harvester and divided into three groups. Group A was prepared as static control group, and the cartilage was preserved in the culture medium statically. Group B was 1.5 MPa group, and group C was 4.0 MPa group. In group B and C, rolling-sliding mechanical stimulation was exerted 30 min each time on cartilage at day 1 and 7, during the preservation process in the culture medium. The culture medium was refreshed every 2 days in all the three groups. Experimental tests were performed on day 14, including the survival rate of chondrocyte, the expression of proteoglycan, histomorphology, and Young's modulus.

The highest chondrocytes survival rate, proteoglycan content and the young's modulus were observed in the 1.5 MPa group across all three groups, and the tissue morphology of group B was good (< 0.05). Compared with the static control group, the above index decreased in the 4.0 MPa group (< 0.05).

Exerting appropriate mechanical stimulation on cartilage can increase the survival rate of chondrocytes, enhance the expression of extracellular matrix, and improve the biomechanical properties of chondrocytes. This provides a new method for cartilage tissue bank.

Cartilage, articular; Extracellular matrix; Mechanical stimulation; In vitro preservation

QI Jian-hong, Email: jhqi7281@163.com

山東省自然科學(xué)基金（ZR2017LH018）

亓建洪，Email：jhqi7281@163.com

2017-12-25

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.009