miR-195在胃癌細胞中的表達及對癌細胞凋亡的機制研究

王啟船，王青，屈中玉，陶海云，趙得堡，萬里新，孫星

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miR-195在胃癌細胞中的表達及對癌細胞凋亡的機制研究

王啟船，王青，屈中玉，陶海云，趙得堡，萬里新，孫星

473009 河南省南陽市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科一病區(qū)（王啟船、屈中玉、陶海云、趙得堡、萬里新、孫星），消毒供應(yīng)中心（王青）

探討 miR-195 在胃癌細胞中的表達及對癌細胞凋亡的影響和機制。

以人胃黏膜正常細胞 GES-1 作為對照，RT-PCR 檢測人胃癌 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞中 miR-195 基因的表達；將 miR-195 mimics 轉(zhuǎn)染 BGC-823 細胞，48 h 后 RT-PCR 檢測 miR-195 的 mRNA 表達；流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western blot 檢測 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達。

miR-195 在 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞中的 mRNA 表達均顯著低于GES-1（< 0.01），miR-195 在 BGC-823 細胞中的表達最低，選擇作為后續(xù)研究對象；過表達組細胞凋亡率及 cleaved caspase3 蛋白表達顯著高于對照組，Notch1、Hes1 蛋白表達顯著低于對照組（< 0.01），而空轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率及 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

miR-195 在胃癌細胞的過表達可促進癌細胞的凋亡，其機制與下調(diào) cleaved caspase3蛋白表達及 Notch1 信號通路有關(guān)。

胃腫瘤； 細胞凋亡； miR-195； Notch1 信號通路

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均較高[1]。胃癌的發(fā)生及發(fā)展是涉及多種致癌信號傳導(dǎo)通路的復(fù)雜過程，其中表觀遺傳的變化受到廣泛關(guān)注。微小 RNA（microRNAs，miRNAs）是在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類新的小分子 RNA，由 19 ~ 25 個核苷酸組成，在進化上高度保守，且不編碼蛋白，可通過與其特異性的靶 mRNA 結(jié)合，降解或抑制蛋白的翻譯，從而對基因的表達進行調(diào)控[2]。研究顯示，在多種惡性腫瘤中 miRNA 的表達出現(xiàn)失調(diào)，而一半以上的人類 miRNA 基因定位于人染色體腫瘤相關(guān)性基因位點，這提示 miRNA 有抑癌或癌基因樣作用[3]。miR-195 是 miR-15a/15b/195/16/497 家族中的一員，定位于人類染色體 17p13.1，該區(qū)域常發(fā)生雜合性缺失，研究顯示，miR-195 與精神分裂癥、心臟病、腫瘤等的發(fā)生及發(fā)展有密切聯(lián)系[4]。在肺癌、肝癌、膀胱癌等多種腫瘤中表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌樣作用[5-7]。但 miR-195 與胃癌的生物學(xué)特性及機制尚不清楚。因此，本研究首先檢測了不同胃癌細胞 miR-195 的表達，檢測過表達后的胃癌細胞的凋亡情況，并進一步探討引起的機制，為胃癌的早期分子診斷及靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃黏膜正常細胞 GES-1 及人胃癌 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所；胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基均購自美國 Gibco 公司；Trizol 試劑、LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen 公司；熒光定量試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara 公司；cleaved caspase3、Notch1、Hes1、GAPDH 抗體均購自美國 Cell Signal Technology 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BCA 試劑盒、Annexin V-FITC 凋亡試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；流式細胞儀購自美國 Becton Dickinson 公司；CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國西盟公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 取出保存在液氮罐中的 GES-1、MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞，置于 37 ℃水浴鍋中解凍后，在 37 ℃、5% CO2、95% 飽和濕度的恒溫孵育箱中用含有 10% 胎牛血清的RPMI1640 細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞生長在 80% ~ 90% 融合度時，用 0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，用完全培養(yǎng)基終止消化，根據(jù)實驗需要傳代。

1.2.2 RT-PCR 檢測胃癌細胞 miR-195 的表達 取生長至對數(shù)期的 GES-1、MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞，Trizol 法提取細胞中的總 RNA，根據(jù)紫外分光光度計檢測的值判斷 RNA 的質(zhì)量，260/280在 1.8 ~ 2.0 被認為是質(zhì)量好的 RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 為模板，U6 作為內(nèi)參基因，RT-PCR 檢測各組細胞中 miR-195 的 mRNA 表達。所有引物由 Primer premier6.0 軟件設(shè)計，并由生工生物工程（上海）有限公司合成。反應(yīng)條件參考產(chǎn)品的說明書。根據(jù) Ct 值利用 2-△△Ct法計算miR-195 的 mRNA 相對表達量。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效果檢測 轉(zhuǎn)染分為3 組，即對照組（不做任何處理）、空轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染空載體）、過表達組（轉(zhuǎn)染 miR-195 模擬物）。轉(zhuǎn)染前 1 天以 5 × 105個/ml 濃度將生長至對數(shù)期的 BGC-823 細胞接種于 6 孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長在 80% 以上融合時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染按照 LipofectamineTM2000 說明進行操作。取轉(zhuǎn)染48 h 的上述三組細胞，提取細胞中的總 RNA，按照 1.2.2 方法檢測各組細胞中 miR-195 的 mRNA 表達。

1.2.4 細胞凋亡檢測 以 1 × 106個/孔將生長至對數(shù)期的 BGC-823 細胞接種于 6 孔細胞培養(yǎng)板中，按照上述分組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 48 h 后收集細胞，根據(jù)細胞凋亡試劑盒操作說明檢測各組細胞的凋亡情況。

1.2.5 Cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達檢測 收集轉(zhuǎn)染后 48 h 的 3 組細胞，加入細胞裂解液置于冰上充分裂解，高速離心后收集上清液，二喹啉甲酸試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液按照 1:5 比例充分混勻后煮沸變性 10 min，取變性蛋白用 12% SDS-PAGE 分離，半干法 PVDF 轉(zhuǎn)膜，5% 的脫脂奶粉 TBST 溶液中室溫封閉 90 min，分別加入 cleaved caspase3、Notch1、Hes1（均按照 1:500 稀釋）和 GAPDH（1:1000 稀釋）一抗，4 ℃過夜，TBST 洗滌 3次，每次10 min，加入 1:5000 稀釋的 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，室溫孵育 1 h，ECL 顯色，顯影后采用 Gel-Pro analyzer 分析各個條帶的光密度，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，分析 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞中 miR-195 的表達

人胃黏膜正常細胞 GES-1 作為對照，RT-PCR 檢測人胃癌 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞中 miR-195 的表達。結(jié)果（圖 1）顯示，miR-195 在 GES-1、MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞中的表達分別為 1.00 ± 0.07、0.71 ± 0.11、0.52 ± 0.09、0.39 ± 0.06，miR-195 在 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞中的 mRNA 表達均顯著低于 GES-1（< 0.01），miR-195 在 BGC-823 細胞中的表達最低，故選擇 BGC-823 作為后續(xù)研究對象。

圖 1 miR-195 在胃癌細胞中的表達（**P < 0.01）

Figure 1 Expression of miR-195 in gastric cancer cells (**< 0.01)

圖 2 過表達 miR-195 后的 BGC-823 細胞中 miR-195 的表達（與對照組比較，**P < 0.01）

Figure 2 Expression of miR-195 in BGC-823 cells after miR-195 overexpression (compared with the control group,**< 0.01)

2.2 過表達 miR-195 后的 BGC-823 細胞中 miR-195 的表達

將對照組、空轉(zhuǎn)染組及 miR-195 過表達組轉(zhuǎn)染 BGC-823 細胞，48 h 后 RT-PCR 檢測各組細胞中 miR-195 的 mRNA 表達。結(jié)果（圖 2）顯示，對照組、空轉(zhuǎn)染組及過表達組 miR-195 的 mRNA 表達分別為 1.00 ± 0.15、1.02 ± 0.14、7.56 ± 0.56，過表達組 miR-195 的 mRNA 表達顯著高于對照組（< 0.01），而空轉(zhuǎn)染組 miR-195 的 mRNA 表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

2.3 過表達 miR-195 促進 BGC-823 細胞凋亡

流式細胞儀檢測過表達 miR-195 的各組 BGC-823 細胞的凋亡情況。結(jié)果（圖 3）顯示，對照組、空轉(zhuǎn)染組及過表達組細胞凋亡率分別為（7.12 ± 1.02）%、（7.16 ± 1.06）%、（17.83 ± 1.23）%，過表達組細胞凋亡率顯著高于對照組（< 0.01），而空轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

2.4 過表達 miR-195 對 BGC-823 細胞 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達的影響

Western blot 檢測過表達 miR-195 后的BGC-823 細胞凋亡相關(guān)蛋白 cleaved caspase3、Notch1 信號通路蛋白 Notch1 和 Hes1 的蛋白表達。結(jié)果（圖 4）顯示，對照組、空轉(zhuǎn)染組及過表達組 cleaved caspase3 蛋白表達分別為 0.052 ± 0.011、0.048 ± 0.010、0.107 ± 0.012，Notch1 蛋白表達分別為 0.778 ± 0.053、0.762 ± 0.051、0.237 ± 0.021，Hes1 蛋白表達分別為 0.341 ± 0.032、0.335 ± 0.030、0.086 ± 0.012，過表達組 cleaved caspase3 蛋白表達顯著高于對照組，而 Notch1、Hes1 蛋白表達顯著低于對照組（< 0.05），空轉(zhuǎn)染組 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05）。

3 討論

miRNA 是一種內(nèi)源性非編碼的小分子 RNA，通過對靶基因的調(diào)控而在多種生命活動過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞的增殖、凋亡、分化、發(fā)育等。有研究表明，大約 60% 的基因編碼蛋白受到 miRNA 的調(diào)控[8]。miRNA 可通過翻譯抑制、切割降解特定的 mRNA 而調(diào)控靶基因的表達、蛋白質(zhì)合成、生物發(fā)育、細胞分化等生物學(xué)行為，進而影響生命過程的各個階段[9]。近些年來的研究表明，在多種腫瘤中 miRNA 有異常表達，有癌基因或抑癌基因樣作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等有密切關(guān)系[10]。miR-195 是 miRNA 家族中的一員，在心、肝、肺、腎、腦組織等均有表達，在心肌肥大、精神分裂癥、癲癇等患者中有異常表達，與腫瘤的發(fā)生也存在密切關(guān)系[11]。研究顯示，miR-195 可通過靶向調(diào)控 Bcl-2、WEE1、CDK6 等基因表達，參與細胞增殖、周期變化、凋亡等生物過程的調(diào)控。在結(jié)直腸癌、腦膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中廣泛的表達下調(diào)，結(jié)直腸癌中 miR-195 的表達下調(diào)與臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)[12]。過表達 miR-195 可抑制腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖、誘導(dǎo) G0/G1 期阻滯，并通過下調(diào) Bcl-2 表達促進細胞的凋亡[13]。miR-195 在胃癌中的研究相對較少。有研究顯示，miR-195 在胃癌中表達降低，其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]，將 miR-195 的模擬物轉(zhuǎn)染胃癌細胞后可明顯降低癌細胞的侵襲及遷移能力[15]。但過表達 miR-195 對胃癌細胞的凋亡及誘導(dǎo)細胞凋亡的方式和調(diào)控的信號通路還未明確。miR-195 在胃癌中表達降低，但在胃癌細胞系中表達情況怎樣還未明確，因此本研究首先以人胃黏膜正常細胞 GES-1 為對照細胞，檢測了在人胃癌 MNK-28、SGC-7901、BGC-823 細胞 miR-195 的表達，發(fā)現(xiàn) BGC-823 細胞 miR-195 的表達最低，因此選擇作為研究對象。通過將 miR-195 的模擬物轉(zhuǎn)染 BGC-823 細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)過表達 miR-195 可誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。

圖 3 過表達 miR-195 對 BGC-823 細胞凋亡的影響（A：流式細胞儀檢測結(jié)果圖；B：各組細胞的凋亡率，與對照組比較，**P < 0.01）

Figure 3 Effect of overexpression of miR-195 on the apoptosis of BGC-823 cells (A: Flow cytometry test results; B: Apoptosis rate of each cell, compared with the control group,**< 0.01)

圖 4 過表達 miR-195 對 BGC-823 細胞 cleaved caspase3、Notch1、Hes1 蛋白表達的影響

Figure 4 Effect of over expression of miR-195 on the expression of cleaved caspase3, Notch1 and Hes1 protein in BGC-823 cells

Notch1 是一條在進化上保守的信號通路，參與細胞的增殖、凋亡、發(fā)育、生存、分化等過程，首先在人類 T 淋巴母細胞白血病中被鑒定出來，目前在腫瘤研究中成為炙手可熱的話題。Notch1信號的異常與胃癌、肺癌等腫瘤的發(fā)生有密切聯(lián)系，其信號的紊亂可通過直接或間接作用引起腫瘤的發(fā)生[16-17]。有研究指出，抑制 Notch1 信號可降低胃癌的發(fā)生及發(fā)展[18]。Caspase3 在 caspase 級聯(lián)反應(yīng)的下游，是該家族中的關(guān)鍵酶和效應(yīng)蛋白，被稱為“凋亡的執(zhí)行者”，在正常情況下無活性，有凋亡信號刺激后被激活，其活化是細胞進入凋亡不可逆階段的標(biāo)志[19-20]。有研究顯示，胃癌細胞中可通過抑制 Notch 信號通路誘導(dǎo)癌細胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的方式是激活 caspase3[21]。因此，本研究試圖證實過表達 miR-195 可通過影響 Notch 信號通路及 caspase3 表達誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。結(jié)果顯示，過表達 miR-195 后 Notch1 及重要靶基因 Hes1 的表達均顯著降低，cleaved caspase3 的表達升高，這提示過表達 miR-195 可通過抑制 Notch1 信號通路誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡，其對凋亡的影響方式是上調(diào) cleaved caspase3 的表達。

綜上所述，胃癌細胞 miR-195 的過表達可通過下調(diào) cleaved caspase3 蛋白表達及Notch1 信號通路促進癌細胞的凋亡。該研究從分子水平上為胃癌的病因?qū)ふ业搅死硐氲臉?biāo)記物，也為該病的診治提供了一定的線索。

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The expression of miR-195 in gastric cancer cells and its mechanism on the apoptosis of cancer cells

WANG Qi-chuan, WANG Qing, QU Zhong-yu, TAO Hai-yun, ZHAO De-bao, WAN Li-xin, SUN Xing

Author Affiliations: Internal Medicine-Oncology (WANG Qi-chuan, QU Zhong-yu, TAO Hai-yun, ZHAO De-bao, WAN Li-xin, SUN Xing), Sterilization and Supply Center (WANG Qing), Nanyang City Center Hospital, Henan 473009, China

To investigate the expression of miR-195 in gastric cancer cells and its influence and mechanism on the apoptosis of cancer cells.

As the control of human gastric mucosa of normal GES-1 cells, miR-195 expression in human gastric cancer SGC-7901, MNK-28, BGC-823 cells were detected by RT-PCR. The miR-195 mimics were transfected into BGC-823 cells. After 48 hours, the mRNA expression of miR-195 was detected by RT-PCR. Apoptosis was detected by flow cytometry. The expression of cleaved caspase3, Notch1, Hes1 protein was detected by Western blot.

The mRNA expression of miR-195 in MNK-28, SGC-7901, BGC-823 cells were significantly lower than that in GES-1 (< 0.01). The expression of miR-195 was lowest in BGC-823 cells and was selected as a follow-up study. Apoptosis rate and cleaved caspase3 protein expression in the overexpression group were significantly higher than those in the control group. The protein expression of Notch1 and Hes1 was significantly lower than that in the control group (< 0.01). However, there was no significant difference of the apoptosis rate, cleaved caspase3, Notch1, and Hes1 protein expression between the empty transfection group and the control group (> 0.05).

Overexpression of miR-195 in gastric cancer cells can promote the apoptosis of cancer cells through up-regulation of cleaved caspase3 protein expression and down-regulation of Notch1 signaling pathway.

Stomach neoplasms; Apoptosis; miR-195; Notch1 signaling pathway

WANG Qi-chuan, Email: ywyrzl@163.com

王啟船，Email：ywyrzl@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.008

2017-11-15