PML/RARα融合基因FISH檢測試劑盒的研究

繆為民，石琳，胡林萍，李娟，劉蕓，李承文，李思奇，杜宏偉，王征宇

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PML/RARα融合基因FISH檢測試劑盒的研究

繆為民，石琳，胡林萍，李娟，劉蕓，李承文，李思奇，杜宏偉，王征宇

300084 天津，協和干細胞基因工程有限公司（繆為民、石琳、李娟、劉蕓、李思奇、杜宏偉）；300020 天津，中國醫學科學院血液病醫院/血液學研究所（繆為民、胡林萍、李承文、王征宇）；300084 天津市血液細胞治療技術企業重點實驗室（石琳、李娟、劉蕓、李思奇、杜宏偉、王征宇）

自主研制用于檢測白血病染色體 PML/RARα 融合基因的雙色熒光原位雜交（FISH）檢測試劑盒。

根據染色體基因圖譜，選定合適的細菌人工染色體（BAC）克隆重疊群分別作為 PML 基因探針和 RARα 基因探針。對入選的 BAC 克隆進行 STS-PCR 鑒定和熒光原位雜交鑒定。最后將完成鑒定的 PML 探針標記紅色熒光素，RARα 探針標記綠色熒光素，加上配套試劑組成 FISH 檢測試劑盒。用雙盲法檢測白血病臨床樣本 37 例，對自制探針和同類進口探針在各項技術參數上進行對比研究。

自制試劑盒檢測 PML/RARα 融合基因與進口探針相比，其陰、陽性率和同類進口產品完全符合；自制探針的熒光信號更強，信噪比更高。

自主研制的 PML/RARα 融合基因 FISH 檢測試劑盒設計合理、質量可靠，可用于替代價格昂貴的進口產品。

白血病； 易位，遺傳； 原位雜交，熒光；PML/RARα 融合基因

15 號染色體長臂 2 區 2 帶和 17 號染色體長臂 1 區 2 帶易位t（15；17）（q22；q21）是急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）所具有的特征型染色體畸變[1]。該染色體改變導致位于 15q22 的早幼粒白血病（PML）基因與位于 17q21 的維甲酸受體α（RARα）基因發生融合[2]。PML/RARα 融合基因在 90% 以上 APL 初發患者均可檢出，已成為 APL 的特異分子標志[3]。APL 也是急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）的一個亞型（M3）[4]。APL 發病兇險、死亡率高，但近年由于誘導分化劑—?全反式維甲酸（ATRA）的應用，骨髓移植的開展以及三氧化二砷聯合用藥，使得 APL 成為 AML 中治療效果和預后最好的一型[5]。靶向藥物 ATRA 可以特異性地抑制 PML/RARα 融合蛋白的活力，從而有效地治療 APL[6]。檢測 PML/RARα 融合基因，一方面可以為 APL 提供初始診斷，進而為 ATRA 靶向治療提供用藥依據。另一方面，還可用于 APL 微小殘余白血病的監測。由于 APL 即使經 ATRA 誘導達完全緩解后，PML/RARα 仍有較高的陽性率，因此，PML/RARα 融合基因陽性率還可用作預后評估的依據。綜上所述，檢測 PML/RARα 具有重大的臨床意義。

目前，檢測 PML/RARα 融合基因有常規細胞遺傳學核型分析法、RT-PCR 法以及 FISH 法[7]。其中，FISH 法以其簡便、準確、敏感和特異等優點，成為檢測 PML/RARα 融合基因的金標準[8]。國際上有美國雅培公司等生產的雙色探針用于檢測 PML/RARα 融合基因，然而價格昂貴。國內尚無經藥監局注冊的 PML/RARα 探針用于臨床檢測。為了滿足國內血液學臨床和科研的需要，我們對 PML/RARα FISH 檢測試劑盒進行了自主研發，并與進口同類產品相比較，報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

質粒純化試劑盒購于德國 Qiagen 公司；R I、ssDNA、tRNA 購于美國 Sigma 公司；質粒 DNA、DNA 聚合酶 I、人cot-1 DNA、核酸雜交緩沖液 SSPE 購于美國 Invitrogen 公司；綠色熒光素 Spectrum Green-dUTP 購于美國Abbott Molecular公司；紅色熒光素 PromoFluor-555-dUTP 購于美國 PromoKine 公司。Axioimager Z2 型熒光顯微鏡購自德國Zeiss 公司；ThermoBrite 原位雜交儀購自美國 Abbott Molecular 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本選擇 選擇在我院就診的臨床初診為急性髓系白血病（AML）的成年患者骨髓細胞作為陽性樣本，AML 診斷依據文獻[9]。

1.2.2 細菌人工染色體 DNA 的 STS-PCR 鑒定 使用 UCSC Genome Bioinformatics 數據庫定位檢索細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆[10]。選擇定位于 15q22 包含 PML 基因的 BAC 克隆重疊群（圖 1A，包括7 個 BAC 克隆），長度達 986 kb，將該 BAC 克隆群標記 PromoFluor-555-dUTP 作為 PML 探針；選擇定位于 17q21 包含 RARα 基因的 BAC 克隆群（圖 1B，包括 7 個 BAC 克隆），長度達1120 kb，將 BAC 克隆群標記 Spectrum Green-dUTP作為 RARα 探針（表 1）。根據基因圖譜，獲取每個 BAC 克隆含有的序列標簽位點（sequence tagged sites，STS）信息。合成相應的 STS 引物，用 PCR 法對每個 BAC 克隆進行相應的 STS 擴增。擴增條件為：94 ℃預變性 5 min；然后每個循環 94 ℃變性 30 s，58 ℃復性 30 s；72 ℃延伸 30 s，32 個循環；再 72 ℃延伸 7 min。

1.2.3 探針制備 用 Qiagen 質粒純化試劑盒分離提取 BAC 的 DNA，然后用R I 酶切DNA。用缺口平移法將熒光素標記 DNA，其中 PromoFluor-555-dUTP 標記 PML 基因，Spectrum Green-dUTP 標記 RARα 基因，乙醇沉淀，最后溶于雜交緩沖液。

1.2.4 骨髓細胞與外周血細胞（間期）樣本制備 取樣本，用 0.075 mol/L KCl 低滲去除紅細胞，細胞甩片后用甲醇室溫固定過夜，第 2 天用 2% 甲醛固定 5 min 后，儲存于–20 ℃ 70% 乙醇中，使用時分別在 70%、85%、100% 乙醇中梯度脫水，晾干后 FISH 檢測備用。

1.2.5 外周血細胞中期染色體樣本制備 接種正常人外周血細胞 1 ml 至染色體培養基中，輕輕混勻，37 ℃培養 72 h。加入秋水仙素（終濃度為0.4 μg/ml），37 ℃作用 1 h。將培養物轉入 15 ml 離心管，1500 r/min 離心 5 min。加入預溫至 37 ℃的低滲液 9 ml，混勻，置 37 ℃水浴 40 min。然后固定，滴片，顯微鏡下觀察中期染色體分裂相形成情況，劃定雜交區域。

1.2.6 FISH 檢測 取制備好的間期和中期細胞片各 30 例，分別加入 2 μl 探針，加蓋蓋玻片，用封片膠封片后 85 ℃變性 5 min，47 ℃雜交24 h，并以 PML/RARα 融合基因試劑盒作為對照組。用 SSPE 于 47 ℃洗滌 5 min，55 ℃洗滌 10 min。梯度乙醇脫水后加 DAPI 復染細胞核，加蓋Zeiss 蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。每張玻片選擇 10 個區域拍照，每個通道分別測量 200 個以上細胞。

圖 1 PML 與 RARα基因圖譜（A：PML 基因位于染色體 15q22，紅色長條表示包含 PML 基因的 BAC 克隆重疊群，長度達 986 kb；B：RARα基因位于染色體 17q21，綠色長條表示包含RARα基因的 BAC 克隆重疊群，長度達 1120 kb）

Figure 1 Gene map of PML and RARα (A: PML gene is located at chromosome 15q22, the red strip shows BAC clones contigs of the PML gene and the length is 986 kb; B: RARα gene is located at chromosome 17q21, the green strip shows BAC clones contigs of the RARα gene and the length is 1120 kb)

表 1 探針制備及使用 BAC 克隆編碼

注：克隆編碼為我們實驗室的編號。

Note: The clone coding was made by our laboratory.

1.2.7 圖像采集及 FISH 信號的檢測 用熒光顯微鏡在 DAPI 圖像下選擇視野，定位，記錄圖像采集位置。分別于 Spectrum Green 和 Cy3TMv1（PromoFluor-555）濾光片下觀察間期細胞熒光雜交信號。于 63 倍油鏡下分別在 DAPI、Spectrum Green、Cy3TMv1 通道中采集細胞核和2 種熒光素的原始圖像，軟件分析合成最后的分類圖像，照相記錄。采用 AxioVisionRel 4.8 軟件分析測量圖像，評估探針雜交情況[11]。每張玻片選擇 10 個區域拍照，每個通道分別測量 200 個以上細胞的平均熒光強度和背景強度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 BAC 克隆的 PCR 鑒定

根據基因圖譜，獲取每個 BAC 克隆含有的 STS 信息后合成相應的 STS 引物，用 PCR 法對每個 BAC 克隆進行相應的 STS 擴增。圖 2 顯示部分 BAC 克隆的 STS-PCR 鑒定結果。

2.2 間期細胞 FISH 檢測

檢測結果顯示，自制探針與進口探針分別與正常人的外周血細胞進行雜交，每組檢測 30 例，由圖 3 可以看出，自制探針與進口探針結果一致，均可以檢出 2 個紅色的信號點和 2 個綠色的信號點。表明正常人細胞含有 2 個獨立的 PML 位點和 2 個獨立的 RARα 位點。

2.3 中期細胞 FISH 檢測

將制備好的 PML/RARα 探針與正常人的外周血細胞中期染色體分裂相雜交，可以觀察到紅色熒光素標記的 PML 探針定位在 15 號染色體，綠色熒光素標記的 RARα 探針定位在 17 號染色體。同樣，自制探針信號點與對照組探針信號點定位一致無誤。（圖 4）。

2.4 自制探針和進口探針用于檢測同一例已知白血病 PML/RARα 染色體易位陽性的樣本

結果顯示，自制探針（圖5A）和進口探針（圖 5B）均可檢出一個獨立的紅色信號和一個獨立的綠色信號，以及 1 個紅色和綠色融合信號（黃色）。結果提示，該病人含有一個正常的 PML 基因拷貝和一個正常的 RARα 基因拷貝，另一個拷貝的 PML 基因和 RARα 發生了重組，形成了 PML/RARα 融合基因。將自制探針與進口探針對比發現，自制探針信號點更為明亮，與上述結果一致，均顯示出自制探針在特異性方面具有更大的優勢。

M：D2000；1：PML-R0（WI-14402）；2：PML-R1（SHGC-79211）；3：PML-R5（RH49076）；4：PML-R6（CTD-2516P6）；5：RARα-R5（142H19M2）；6：RARα-R7（RH12872）；7：RARα-R8（RH17717）；8：RARα-R9（SHGC-111679）；9：空白對照

Figure 2 STS-PCR electrophoretogram

圖 3 PML/RARα探針與已知正常人外周血間期細胞雜交（A：自制探針；B：進口探針）

Figure 3 The PML/RARα probes were hybridized with peripheral blood interphase cells of normal human (A: Self-made probes; B: Imported probes)

圖 4 PML/RARα 探針與已知正常人外周血中期細胞雜交（A：自制探針；B：進口探針）

Figure 4 The PML/RARα probes were hybridized with peripheral blood metaphase cells of normal human (A: Self-made probes; B: Imported probes)

2.5 自制和進口 FISH 探針的對比研究

通過雙盲法檢測 37 例臨床血液病門診樣本，結果顯示自制和進口 FISH 探針均檢測到其中相同的 5 例 PML/RARα 易位陽性的樣本，兩者陰陽性檢測結果完全相符。采用 AxioVision Re 1.4.8 軟件進行圖像分析和測量，在 Spectrum Green 和 Cy3TMv1（PromoFluor-555）通道中，自制探針的平均熒光信號強度比進口探針明顯提高（< 0.05），自制探針信噪比分別為進口探針的 2.1 倍和 1.5 倍（圖 6）。

圖 5 自制探針（A）和進口探針（B）檢測同一例已知 PML/RARα 易位陽性的患者骨髓樣本

Figure 5 Self-made probes (A) and imported probe (B) were used to detect bone marrow samples from the same patient with known PML/RARα translocation

圖 6 自制探針與進口探針的信號平均熒光強度和背景強度比較（*P<0.01）

Figure 6 Comparison of average fluorescence intensity and background intensity of self-made and imported probes (*<0.01)

3 討論

染色體畸變，包括染色體缺失、擴增、重排等是引起血液病的重要發病機制[12]。不同的染色體變異引起不同類型的血液病，其治療方案及預后結果均有顯著的不同。FISH 利用特異性熒光標記探針與標本 DNA 雜交，檢測細胞染色體、基因組異常，可應用于細胞分裂中期、間期染色體，檢測包括染色體數目、復制和異位等異常，并能發現隱秘異位突變[13]，因此已成為血液病精準診療以及微小殘留病監測中必不可少的分子診斷工具。

目前，國內血液學臨床及科研對于血液病 FISH 診斷試劑盒有巨大的需求。但由于大部分產品仍依賴進口，價格昂貴，使得臨床和科研應用均受到很大的限制，同時也給患者帶來沉重的經濟負擔。因此，有必要自主開發具有國際先進水平的血液病 FISH 檢測試劑盒，以滿足國內臨床和科研的需要。

本實驗自主設計 PML/RARα 基因 FISH 探針，尤其采用多個 BAC 克隆組成的克隆重疊群作為探針，本實驗中共含有 14 個 BAC，其中 PML 有 7 個 BAC，長度為 986 kb，RARα 含有 7 個 BAC，長度為 1120 kb（圖 1），大大提高了 FISH 雜交熒光信號的強度。同時我們在雜交緩沖液中加入ssDNA、tRNA 和 cot-1 DNA 等試劑封閉基因組中的重復序列，使得非特異性雜交信號顯著下降，這些綜合措施顯著增強了探針信噪比。因此，大幅度增強了 PML/RARα 探針的信號強度及可視性。對 37 例臨床血液病樣本的檢測結果顯示，自制和進口 FISH 探針在檢測 PML/RARα 染色體重組陰、陽性的結果是完全一致的（圖 5）。另外，其他方面的技術指標，如外觀、物理性狀、熒光淬滅性、冷藏穩定性等也都達到了國外同類產品的標準，表明我們自主研發的 PML/RARα FISH 檢測試劑盒達到了國際先進水平，可以替代國外同類品牌產品。

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Development of FISH diagnostic kit for detection of PML/RARα fusion gene in leukemia

MIAO Wei-min, SHI Lin, HU Lin-ping, LI Juan, LIU Yun, LI Cheng-wen, LI Si-qi, DU Hong-wei, WANG Zheng-yu

Author Affiliations: Stem Cell and Gene Bioengineering Co. Ltd., Tianjin 300084, China (MIAO Wei-min, SHI Lin, LI Juan, LIU Yun, LI Si-qi, DU Hong-wei); Institute of Hematologyand Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China (MIAO Wei-min, HU Lin-ping, LI Cheng-wen, WANG Zheng-yu); Tianjin Key Laboratory of Blood Cell Therapy and Technology, Tianjin 300084, China (SHI Lin, LI Juan, LIU Yun, LI Si-qi, DU Hong-wei, WANG Zheng-yu)

To develop a dual-colour FISH kit for detecting the leukemia PML/RARα fusion gene.

Based on the chromosome and gene map, corresponding BAC clone contigs were selected as PML and RARα FISH probes located on chromosome 15q22 and 17q21 respectively. The PML FISH and RARα probes were labeled with red and green fluorophores, respectively. The self-developed FISH kit and the commercial imported one were compared in terms of multiple technical parameters detected by double blind studies of 37 cases of clinical hematological samples.

The detection results were consistent between the self-developed FISH kit and the commercial imported one with respect to detecting PML/RARα gene translocation. The self-developed probes were comparable to the commercial imported FISH probes in terms of multiple technical parameters, such as appearance, physical characteristics, fluorencence quench and stability at cold storage. Furthermore, the self-developed probes possessed stronger fluorescence signal intensities and better signal noise ratios than the imported probes did.

The FISH diagnostic kit developed in this work could serve as a domestic replacement for the expensive imported products.

Leukemia; Translocation, genetic; In situ hybridization, fluorescence; PML/RARα fusion gene

MIAO Wei-min, Email: miaow@ihcams.ac.cn

國家自然科學基金（81400150、81370598）；天津市科委項目（14ZCDZSY00176）；中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程項目（2016-12M-1-017）

繆為民，Email：miaow@ihcams.ac.cn

2018-01-29

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.03.005