不同血清量標本外泌體提取及微小RNA的檢測結果比較

王倩倩，盧川，陳良，黃玉仙

1. 復旦大學附屬公共衛生臨床中心肝炎一科，上海 201508； 2. 復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040

1985年Pan等[1]首次發現，外泌體是哺乳動物網織紅細胞成熟過程中分泌的直徑為40～100 nm的膜性小囊泡，電子顯微鏡下呈茶托形或一側凹陷的半球形。外泌體由體內各種活細胞分泌，廣泛分布于血液、尿液、乳汁等體液中[2]。外泌體含有豐富的蛋白質、脂質、微小RNA(microRNA, miRNA)等內容物[3]，這些生物信息分子會隨疾病進展、轉歸發生變化，是頗具臨床診斷價值的循環標記[4-5]。因此，提取高純度的外泌體用于后續臨床診斷具有重要實用價值[6]。根據外泌體的大小、密度和表面標記等物理化學性質，目前獲取外泌體的方法有經典的超速離心法、沉淀法、免疫親和捕獲法、分子排阻層析等[7-11]。近幾年來，德國Qiagen公司研發的外泌體提取試劑盒exoRNeasy利用膜親和吸附原理，可直接獲取血清外泌體的總RNA[12]，便于操作且效率高，適用于大規模提取血清標本進行后續miRNA測序和 定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)等實驗[13]。但是，exoRNeasy操作手冊規定提取血清外泌體所需標準血清量為1～4 mL ,而臨床實踐中患者血清標本珍貴且體積有限，能否用較少的血清量達到預期的實驗效果值得探索。本研究以健康人和慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者血清為樣本，利用exoRNeasy Serum/Plasma Midi試劑盒提取250、500、1 000 μL血清外泌體中RNA，并對miRNA相對表達量進行對比分析，選取能檢測外泌體中miRNA的最小血清體積，為后續研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機篩選2017年9—11月上海市公共衛生臨床中心肝病科乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B virus e antigen, HBeAg)陽性CHB初治患者9例，無基礎疾病健康者9例。……