雙合湯對膝骨性關節(jié)炎大鼠作用的試驗

胡 蘭,楊康棟,劉鴻杰,劉偉成,凌 敏

(廣州中醫(yī)藥大學體育健康學院,廣東 廣州 510006)

膝骨性關節(jié)炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種膝關節(jié)炎軟骨退行性病變和繼發(fā)骨質(zhì)增生為主要表現(xiàn)的慢性、進展性、退行性關節(jié)病變,主要累及軟骨、滑膜、關節(jié)囊等結構[1],占所有骨性關節(jié)炎的50%。流行病學調(diào)查顯示,我國膝骨性關節(jié)炎的患病率高達15%,60歲以上達50%[2-3]。并且隨著人口老齡化的進程加速,生活、運動方式的改變,膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病率呈上升的趨勢。不僅嚴重影響人民的生命健康,也對生活、工作、學習造成一定的影響。目前膝骨性關節(jié)炎治療手段眾多,僅能減緩癥狀,但是未能從根本上改變膝骨性關節(jié)炎的病理生理進程[4],究其原因是膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制尚不明確[5]。有研究指出,白細胞介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、白細胞介素 -6(Interleukin-6,IL-6)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)可能介導膝骨性關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展[6-7]。中醫(yī)藥治療膝骨性關節(jié)炎具有獨特的優(yōu)勢,可以改善癥狀,提高生活質(zhì)量,減緩病程[8-9]。但是關于其作用機制尚不明了。因此,本試驗建立了膝骨性關節(jié)炎大鼠模型,用雙合湯進行干預,觀察其對關節(jié)活動范圍、關節(jié)滑膜厚度和關節(jié)液中IL-1β、IL-9、NO、iNOS的水平的影響,探討其防治膝骨性關節(jié)炎的可能機制,報告如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和飼料 SD健康雄性大鼠80只,SPF級,9周齡,體重190 g±10 g;基礎飼料;上述產(chǎn)品均由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2013-0002。

1.1.2藥品 雙合湯(當歸15 g,川芎15 g,白芍20 g,生地黃15 g,陳皮6 g,法半夏15 g,茯苓15 g,桃仁15 g,紅花10 g,白芥子10 g,甘草6 g,桑寄生15 g,杜仲15 g),由廣東康美藥業(yè)股份有限公司提供,每味中藥分開包裝,經(jīng)營許可證號為粵AA2001217;將上述中藥飲片加8倍量的水浸泡30 min后,煎煮40 min取藥液過濾另存,再加6倍量的水煎煮40 min后取液過濾,兩次藥液混合,置于100℃環(huán)境濃縮至1 mL,相當于原藥6 g,置于冰箱保存。硫酸氨基葡萄糖片(商品名:保節(jié)力,新興同仁藥業(yè)有限公司產(chǎn)品),規(guī)格:240 mg/片,42片/盒,國藥準字H20060802,批號2016090)。

1.1.3試劑和儀器 大鼠關節(jié)液血清 IL-1β、IL-6、iNOS ELLISA試劑盒(美國R&D Systems公司產(chǎn)品,上海通蔚實業(yè)有限公司提供);NO測定試劑盒(上海信帆生物科技有限公司產(chǎn)品);上海恒平AE523C電子分析天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司產(chǎn)品);TGL16D冷凍離心機(湖南邁達儀器有限公司產(chǎn)品);日立熒光分光光度計F-2700(廣州市儀德科學儀器有限公司產(chǎn)品);水合氯醛(揚州市奧鑫助劑廠產(chǎn)品);902-ULTS超低溫冰箱(美國Thermo(賽默飛)產(chǎn)品)。

1.2方法

1.2.1造模方法和分組 所有大鼠在造模前置于室溫(24℃ ±2℃)、濕度(50% ±5%)條件下給予基礎飼料適應性喂養(yǎng)1周,待其代謝狀態(tài)穩(wěn)定后隨機分為假手術組(20只)、模型組(60只),每6只分籠喂養(yǎng)。參照Panicker等[10]制備大鼠膝骨性關節(jié)炎模型:腹腔水合氯醛麻醉下于雙膝關節(jié)腔內(nèi)注射濃度為4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL,每2天1次,共注射2周。假手術組雙膝關節(jié)腔注射等量的生理鹽水。造模期間所有大鼠均自由進食基礎日糧和蒸餾水。2周后若大鼠膝關節(jié)Lequesne MG大于4分為建模成功[11]。2周后,空白對照組20只全部存活,模型組死亡1只,2只未達KOA模型的標準,予以剔除,剩下57只隨機分為模型組(n=19)、氨基葡萄糖組(n=19)和雙合湯組(n=19)。

1.2.2給藥方法 參照人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表,氨基葡萄糖組給予硫酸氨基葡萄糖劑量為86.4 mg/kg·d,加生理鹽水配成22 mg/mL的濃度灌胃,雙合湯組給予12 g/kg·d柴胡舒肝散灌胃,日灌胃1次。假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃,給藥周期為4周。

1.2.3實驗室指標檢測 分別在2周和6周各取一半的大鼠進行檢測。10%水合氯醛溶液(3 mL/kg體重)經(jīng)腹腔注射麻醉,于外膝眼處向關節(jié)腔內(nèi)注入0.5 mL生理鹽水后,反復活動關節(jié)后抽取關節(jié)液,3 000 r/min離心20 min后取上清液,-70℃保存。ELISA法測定關節(jié)液IL-1β、IL-6、iNOS的水平,用硝酸還原酶法測定NO濃度。

1.2.4大鼠關節(jié)后動度 麻醉狀態(tài)下,用相等的力伸展后回縮大鼠膝關節(jié),用量角器測量其伸展至回縮的角度[12]。

1.2.5關節(jié)滑膜厚度 處死大鼠,打開關節(jié)腔后刮取關節(jié)面上的滑膜組織,用螺旋測微器測定關節(jié)滑膜厚度[12]。

1.2.6統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理,計量資料用±s表示。多組間計量資料比較采用單因素方差分析檢驗方法,兩組間計量資料比較采用LSD-t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組大鼠關節(jié)活動范圍、關節(jié)滑膜厚度的檢測結果 造模2周后,模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關節(jié)活動范圍低于假手術組,關節(jié)滑膜厚度明顯高于假手術組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);藥物干預4周后,跟對照組相比,模型組關節(jié)活動范圍繼續(xù)降低,關節(jié)滑膜厚度繼續(xù)增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);跟模型組比較,雙合湯組大鼠關節(jié)活動范圍明顯升高,關節(jié)滑膜厚度明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2各組大鼠關節(jié)液IL-1β、IL-6的檢測結果造模2周后,模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關節(jié)液IL-1β、IL-6水平明顯高于假手術組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);藥物干預4周后,跟對照組相比,模型組大鼠關節(jié)液IL-1β、IL-6水平繼續(xù)增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);跟模型組比較,雙合湯組大鼠關節(jié)液IL-1β、IL-6水平明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1　各組大鼠關節(jié)活動范圍、關節(jié)滑膜厚度的檢測結果

表2　各組大鼠關節(jié)液IL-1β、IL-6的檢測結果　(μmol/L)

2.3各組大鼠關節(jié)液NO、iNOS的檢測結果 造模2周后,模型組、氨基葡萄糖組和雙合湯組大鼠的關節(jié)液NO、iNOS水平明顯高于假手術組,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);藥物干預4周后,跟對照組相比,模型組大鼠關節(jié)液NO、iNOS水平繼續(xù)增加,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);跟模型組比較,雙合湯組大鼠關節(jié)液NO、iNOS水平明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3　各組大鼠關節(jié)液NO、iNOS的檢測結果

3　討論

膝骨性關節(jié)炎是骨科常見病和多發(fā)病之一,臨床主要表現(xiàn)為關節(jié)僵硬、活動受限等。本病不僅嚴重影響人們的身心健康,而且影響生活、工作、學習等。隨著老齡化進程的加速,膝骨性關節(jié)炎的發(fā)病率和患病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。目前臨床上治療膝骨性關節(jié)炎的手段較多,但是因為基本不能減緩膝骨性關節(jié)炎的病理生理學進程,因而臨床效果受到一定的限制。中醫(yī)藥治療本病可以改善膝關節(jié)功能,提高生活質(zhì)量,應用越來越廣泛,但是關于其作用機制尚不明確。

大量研究表明,炎癥因子在膝骨性關節(jié)的發(fā)生發(fā)展過程中起到非常重要的作用,膝關節(jié)腔局部內(nèi)環(huán)境的變化可以誘導多種炎性因子的產(chǎn)生,炎癥因子作用于滑膜、軟骨細胞等從而誘導膝骨性關節(jié)炎的發(fā)生。iNOS是誘導型NO合酶,可以促進NO的合成,正常關節(jié)細胞不產(chǎn)生iNOS,當關節(jié)發(fā)生骨性關節(jié)炎時,軟骨和滑膜細胞可以產(chǎn)生iNOS[13],從而促進NO的分泌和釋放。NO是膝骨性關節(jié)炎重要的炎癥介質(zhì),由關節(jié)內(nèi)細胞產(chǎn)生,其可以促進基質(zhì)金屬蛋白酶激活,導致骨蛋白聚糖和膠原裂解,繼而促進軟骨細胞凋亡[14-15]。NO還可以促進IL-1β的表達,IL-1β可以導致關節(jié)細胞線粒體功能紊亂,使關節(jié)細胞功能減少,促進細胞凋亡,導致軟骨基質(zhì)合成和代謝失衡,促進滑膜炎的發(fā)生[16]。IL-6有多種炎性細胞產(chǎn)生的活性因子,是最強的骨吸收刺激因子,可以促進破骨前體細胞活化為破骨細胞,破壞正常關節(jié)結構。IL-6還可以促進IL-1誘導產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶-1,促進細胞基質(zhì)的裂解。

關于膝骨性關節(jié)炎大鼠模型建立的方法主要有切斷膝關節(jié)炎前交叉韌帶、木瓜蛋白酶注射法、卵巢切除法等。由于關節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法具有復制成功率高、穩(wěn)定可靠等優(yōu)勢,是目前試驗研究中最常見的模型建立方法。本組試驗采用關節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶法建立膝骨性關節(jié)炎大鼠模型,結果提示,造模2周后模型組大鼠力竭關節(jié)活動范圍明顯減少,關節(jié)滑膜厚度明顯增加,提示膝骨性關節(jié)炎大鼠模型復制成功。

膝骨性關節(jié)炎屬于中醫(yī)學“痹病”范疇,中醫(yī)學認為本病為本虛標實之病,本虛為肝腎虧虛,標實為風寒濕、血瘀痹阻筋絡,肝腎虧虛貫穿疾病的始終,風寒濕、血瘀是重要的病理產(chǎn)物,也是重要的中心環(huán)節(jié)。雙合湯養(yǎng)血活血,健脾化痰。方中當歸活血養(yǎng)血,川芎、桃仁、紅花活血化瘀,桑寄生、杜仲補腎壯腰強骨,生地、白芍養(yǎng)陰生津,陳皮、法半夏、白芥子燥濕化痰,茯苓、甘草健脾化濕。諸藥合用,共奏養(yǎng)血活血,健脾化痰之功效。本實驗發(fā)現(xiàn),造模成功后膝骨性關節(jié)炎大鼠給予藥物灌胃4周后,雙合湯組大鼠關節(jié)活動范圍增加,關節(jié)滑膜厚度降低,關節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO、iNOS水平明顯降低。表明炙甘草湯可以降低代謝綜合征大鼠關節(jié)液 IL-1β、IL-6、NO、iNOS水平,改善膝關節(jié)功能,發(fā)揮治療膝骨性關節(jié)炎的作用。

綜上,雙合湯對治療膝骨性關節(jié)炎是有效的,可以改善膝關節(jié)功能,可能與其降低關節(jié)液中IL-1β、IL-6、NO、iNOS 水平的表達有關。