高效液相色譜熒光檢測法測定牛奶中4種氟喹諾酮類藥物殘留

廖潔丹,李智麗,張濟培,陳建紅,楊 鴻

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院,廣東 佛山 528225)

氟喹諾酮類(fluoroquinolones,FQs)是一類人工合成的抗菌藥物,因其吸收好、組織濃度高、與其他藥物交叉耐用性少等優點被廣泛應用獸醫臨床和水產養殖。由于人們對FQs藥物的不合理使用以及不遵守該類藥物的休藥期,食品中殘留低濃度的藥物誘導人類致病菌耐藥性逐年增加,FQs在動物性食品中的殘留問題引起廣泛關注,國內外研究報道了動物性食品中獸藥殘留分析方法[1-2]。目前,牛奶中獸藥殘留的檢測方法主要有微生物檢測法[3]、分光光度法[4]、酶聯免疫檢測法[5-6]、膠體金免疫層析法[7]、高效液相色譜法[8-9]、高效液相色譜—質譜串聯法[10]、毛細管電泳法[11]、適配體傳感器檢測法[12]等。我國國家標準《牛奶中氟喹諾酮類藥物多殘留的測定(GB29692-2013)》由于需專業的操作人員,且受設備條件、實驗成本和操作繁瑣等限制,使其在國內較難普及[13]。本研究旨在建立一種方法簡單、快速、靈敏度高,同時滿足檢測牛奶中4種氟喹諾酮類藥物殘留的檢測方法。

1　材料與方法

1.1儀器與設備 高效液相色譜儀(Agilent 1100)、電子分析天平、離心機、微型混合器、多功能振蕩器、微量移液器等。

1.2試劑 恩諾沙星對照品(含量100.0%)、鹽酸環丙沙星對照品(含量99.8%)、沙拉沙星對照品(含量99.6%),購自中國獸醫藥品監察所;二氟沙星原料藥(含量100.6%),購自廣州惠華有限公司;檸檬酸、乙酸銨、三乙胺、甲醇、正己烷(國產分析純);乙腈(色譜純,Fisher Scientific公司);提取液為65 μL磷酸 +4 mL甲醇溶液;流動相:準確稱取10.55 g檸檬酸和7.86 g乙酸銨,用去離子水溶解,加水稀釋至1 000 mL,然后加三乙胺調pH值至2.4即為水相,水相與乙腈(85∶15,V/V)。

1.3溶液配置

1.3.1標準儲備液 稱取恩諾沙星對照品0.0100 g和沙拉沙星對照品0.0110 g,分別用10%醋酸溶解后甲醇定容至10 mL;稱取鹽酸環丙沙星對照品0.0116 g和鹽酸二氟沙星原料藥0.0099 g,分別用超純水溶解后甲醇定容至10 mL;分別制得終濃度為1 mg/mL的4種標準儲備液。

1.3.2混合標準工作液 取以上4種標準儲備液各1 mL,用甲醇稀釋并定容制備終濃度為100 μg/mL標準工作液Ⅰ。取1 mL標準工作液Ⅰ,用甲醇稀釋并定容制備終濃度為10 μg/mL的標準工作液Ⅱ。取標準工作液Ⅱ,用甲醇稀釋制備0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL 7 個系列濃度的混合氟喹諾酮標準工作液Ⅲ,存放于4℃冰箱。

1.4色譜條件 色譜柱 Hypersil BDS-C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm);熒光檢測器,激發波長(λex=278 nm),發射波長(λem=465 nm),流動相為 0.05 mol/L檸檬酸/0.1 mol/L乙酸銨—乙腈(85∶15,V/V),使用前先用微孔濾膜過濾;柱溫:40℃,流速1.0 mL/min,進樣量 30 μL。

1.5乳樣品預處理 準確吸取1 mL乳樣品于15 mL塑料離心管中,加入100 μL混合氟喹諾酮的系列濃度標準工作液Ⅲ,旋渦混合器上混合30 s,靜置30 min。加入65 μL磷酸+4 mL甲醇溶液,旋渦30 s以上;水平振蕩30 min,靜置5 min。6 000 r/min離心6 min,將上清移至15 mL塑料離心管,殘渣用65 μL磷酸和4 mL甲醇溶液再次提取后合并上清。于上清中加入4 mL正己烷,旋渦混勻后靜置5 min至分層清晰,將上層棄掉。剩余物78℃水浴,空氣吹干。上述殘渣用1 mL流動相溶解并移至1.5 mL EP 管,12 000 r/min 離心6 min。 上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

1.6標準曲線及線性范圍 準確吸取1 mL空白乳樣品置于8支塑料離心管中,取100 μL共7個系列濃度的混合氟喹諾酮標準工作液Ⅲ,旋渦混合30 s,靜置30 min,其中第1管不加藥物對照。按1.5方法預處理,按1.4色譜條件從低濃度到高濃度測定,將測得的FQs藥物的色譜峰面積(A)與相對應的藥物濃度(C)作直線回歸,求得標準曲線回歸方程的線性范圍。

1.7檢測限及定量限 取牛奶空白乳樣品進行添加回收試驗,按照1.5乳樣品前處理方法處理后進行HPLC分析。以信噪比法(S/N≥10),且在該添加水平的回收率和變異系數均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(limit of quantity,LOQ);以信噪比法(S/N=3)作為藥物的檢測限(limit of detection,LOD),分別確定4種氟喹諾酮類藥物的定量限和檢測限。

1.8準確度和精密度 在1 mL空白乳汁樣品中分別添加 5 個不同濃度(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的 FQs藥物標準工作液Ⅲ,按1.5乳樣品處理方法,1.4色譜分析。每個濃度做5個平行樣品,同時進行空白對照,共做4個批次(日間),計算每個樣品的回收率、批內和批間的變異系數。

2　結果與分析

2.1標準曲線及線性范圍 添加氟喹諾酮系列標準工作液Ⅲ的乳樣品按1.5方法預處理,按1.4色譜條件測定,乳樣品中4種FQs藥物與樣品中其他成分有效分離。將FQs藥物的色譜峰面積(A)與相對應的藥物濃度(C)作直線回歸,求得標準曲線回歸方程的線性范圍為0.01～1.00 μg/mL內呈良好的線性關系(R=0.999 9),結果見圖1。

2.2色譜圖 空白乳樣品按1.5方法預處理,按1.4色譜條件檢測。結果表明,空白乳樣品對4種氟喹諾酮類藥物的對應保留時間處所測的分析物均無干擾。圖2～圖4分別是空白乳樣品、FQs藥物混合標準品(0.10 μg/mL)及添加 FQs藥物乳樣品(0.10 μg/mL)的色譜圖。本試驗在1 L流動相中加入1 mL三乙胺調pH值至2.4,消除FQs藥物的兩性化合物中硅羥基的影響,抑制其解離,改善峰形。由色譜圖可見,預處理后乳樣品各組分分離度較佳,色譜峰形好且保留時間合理,出峰時間分別為環丙沙星 6.621 min、恩諾沙星9.684 min、沙拉沙星 12.883 min、二氟沙星 15.731 min。

本文利用常規氣象觀測資料、NCEP/FNL 1°×1°逐6 h再分析資料等,結合中尺度數值模式WRF對2016年3月16—17日發生在華東沿海的一次大范圍平流霧成因進行數值模擬研究,主要結論如下:

圖2　空白乳樣品色譜圖

圖3　FQs標準品(100 ng/mL)色譜圖

圖4　牛奶中添加FQs(100 ng/mL)色譜圖

2.3檢測限及定量限 按照S/N=3計算,環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在牛奶中的檢測限均為5 ng/mL,二氟沙星在牛奶中的檢測限為8 ng/mL。在空白乳汁樣品中分別添加5個濃度(0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL)的FQs藥物標準溶液,每種濃度5個樣品,按1.5乳樣品處理后HPLC檢測。結果顯示,牛奶中4種FQs藥物的添加濃度為10 ng/mL時,S/N≥10,且回收率均大于87%,變異系數小9.84%。因此,環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星定量限均為10 ng/mL。

2.4準確度和精密度 采用添加法選取5種不同添加濃度(0.01,0.05,0.10,0.50,1.00 μg/mL),以上5種濃度包含4種FQs藥物殘留檢測的要求。每種濃度5個樣品,重復4批次。測定結果顯示,牛奶乳樣品中環丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的回收率分別為80% ～92%,77% ～91%,81% ～93%,78% ～88%。本方法的批內、批間的變異系數均值分別為5.29%和7.83%。結果表明,本研究建立的檢測方法準確度和精密度良好。

3　討論

3.1色譜條件的優化 色譜分析法是檢測牛奶中獸藥殘留的常用方法[4],國內學者也對牛奶中FQs藥物多殘留檢測進行相關研究報道[13-15]。由于FQs在食品和環境中殘留量極低,建立高靈敏度和準確度的分析方法是檢測的關鍵,選擇合適的色譜操作條件至關重要。柱溫、流動相組份的比例以及流速等都直接影響柱壓,從而改變了樣品組份的保留時間。本試驗發現室溫條件下色譜峰形欠佳且分離度不完全,40℃ 柱溫效果最佳。因為FQs藥物在酸性條件下熒光強度較高,且出峰時間對乙腈敏感,本研究的流動相水相選用0.05 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L乙酸銨并用三乙胺調整pH值為2.4改善峰形,嘗試14%,15%,16%,17%,18%乙腈濃度避開樣品中的干擾峰,乙腈比例加大藥物出峰時間前移。結果表明,選用上述水相和15%乙腈為有機相可在17 min內完成樣品中4種氟喹諾酮類藥物殘留檢測,與楊勇等[13]報道的測定牛奶中6種氟喹諾酮類藥物殘留方法比較,縮短了樣品檢測時間且分離度最佳。此外,為了避免各組織樣品提取液中的微量蛋白、脂肪等物質縮短色譜柱的壽命,我們在色譜分析柱前加C18保護柱進行保護。

3.2樣品前處理方法的選擇 牛奶中含有大量的脂類、蛋白質等干擾物質影響色譜分離和檢測,樣品前處理方法的選擇與藥物殘留的種類、檢測手段以及樣品基質復雜程度有關[16],是檢測分析的關鍵步驟[17]。迄今為止,沉淀法、液液萃取和固相萃取[17-18]是較為常用的樣品前處理技術,固相微萃取和分子印跡固相萃取聯用[19]、基質固相分散萃取[17]、超臨界流體萃取[20]、Qu ECh ERS技術[17,21-23]在藥物多殘留分析方面的應用范圍也逐漸擴大。近年來,濁點萃取(Cloud Point Extraction,CPE)技術也逐步應用于牛奶中FQs藥物的殘留檢測[24-25]。本研究曾用乙腈-10%三氯乙酸(3∶7,V/V)為提取液,通過SPE凈化后濃縮上樣,結果發現回收率和定量限與磷酸-甲醇提取液提取效果類似,但因SPE柱凈化成本較高,操作者熟練程度會影響樣品的回收率以及變異系數,最終選擇了后者作為前處理方法。本研究也在提取液的用量以及提取次數比較其回收率,結果表明,提取液為3 mL時回收率偏低,4 mL與6 mL無明顯差別,提取兩次的回收率較高,最終選用了65 μL磷酸與4 mL甲醇提取兩次后揮干定容。

本試驗建立的氟喹諾酮類藥物多殘留檢測方法比已報道的牛奶中FQs藥物殘留檢測相比較[14,26]具更高的準確度和精密度。因此,本試驗建立的殘留檢測方法簡單、快速、靈敏度高、準確度和精密度好,適用于牛奶中4種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。