小鼠生長遲緩模型的建立及指標評價

朱玉欣,馬維超,范永超,馮 波,張 倩,董 虹,穆 祥

[1.北京農學院動物科技學院 北京農學院獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室,北京 昌平 102206;2.中國農業大學動物醫學院 ,北京 海淀 100193]

抗生素作為飼料添加劑具有促進機體生長的作用,但長期、大量地使用抗生素會給動物源性食品安全帶來諸多問題,因此世界各國開始限制或禁止抗生素在飼料中的使用,并開始研發新型促生長飼料添加劑來逐步替代抗生素。目前,關于飼料添加用抗生素促生長的機理尚不完全清楚。通過查閱文獻及本團隊前期研究,我們認為抗生素促生長的機制可能是抑制了飼料在儲藏過程中細菌的增殖,進而減少細菌毒素的釋放。反之,飼喂含有大量細菌或毒素的飼料會導致動物生長遲緩。因此,本研究嘗試通過灌服細菌懸液及細菌毒素的方式建立小鼠生長遲緩模型,期望能夠為研發具有細菌毒素滅活作用的中藥飼料添加劑提供動物模型。

1　材料

1.1試驗菌株及試驗材料 大腸桿菌K99來自北京農學院,獸醫學(中醫藥)北京市重點實驗室保藏;Yeast Extract、Tryptone,均購自 OXOID 公司,批號分別為LP0021、LP0042;NaCl,購自VETEC公司,批號V900058-500G;麥康凱培養基,購自北京奧博星生物技術有限責任公司,批號02-005A;小鼠IL-6試劑盒及TNF-α試劑盒,均購自美國R&D公司;SPF級BALB/c雄性小鼠,體重10-12 g,80只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]。

1.2試驗儀器 生物安全柜(Thermo公司);電子天平(上海天平儀器廠);渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);精密pH計(SANYO公司);顯微鏡(OLYMPUS公司);細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司);多功能酶標儀(美國BIOTEK公司);全溫振蕩培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

2　方法

2.1大腸桿菌的培養及破碎 將凍存的大腸桿菌K99室溫融化后接種到5 mL LB培養基中,37℃,220 r/min,培養24 h。將100 μL此菌液接種到5 mL LB培養基中,培養18 h,劃線接種到麥康凱平板培養基上培養18 h,挑取狀態良好的單菌落接種到LB培養基中,進行增菌鏡檢。取純化后的菌液100 μL接種到5 mL LB培養基中,共接18管,37℃,220 r/min,分別在 16、18、20、22、24 h 取 3 管,測定生長曲線。根據生長曲線選擇細菌破碎時間。將大腸桿菌菌體懸液放入50 mL小燒杯中,超聲破碎儀進行破碎,每間隔5 s破碎5 s;每5 min檢測一次菌體破碎液的OD600nm值(600 nm),破碎10 min后,取少量液體進行革蘭染色鏡檢,觀察細菌狀態。

2.2動物分組 將80只SPF級BALB/c雄性小鼠分為4組,每組20只。空白組、上清組、破碎組、懸液組分別給予生理鹽水、細菌上清、破碎液及細菌懸液,0.2 mL/只,連續灌胃 15 d。

2.4炎性因子的測定 對稱量完體重的各組小鼠進行眼球采血,室溫靜置1 h,3 000 r/min離心15 min后收集血清,使用ELISA試劑盒測定IL-6、TNF-α的水平。

2.5臟器指數的測定 脫頸處死采血后的各組小鼠,采集肺臟、肝臟、脾臟并稱重,計算臟器指數。計算公式為:臟器指數=臟器重量(ɡ)/活體重(ɡ)。

2.6統計分析 使用SPASS 17.0統計軟件進行數據處理,采用獨立樣本t檢驗,試驗數據均以平均值±標準差表示,P≤0.05為差異顯著,P≤0.01為差異極顯著。

3　結果

3.1大腸桿菌K99生長曲線 如圖1所示,在培養到16～20 h細菌達到平臺期,在22 h時活菌數達到最大,之后隨著時間的延長活菌數下降。

圖1　細菌生長曲線

3.2細菌破碎時間的篩選 在10 min之內,隨著破碎時間的延長,細菌懸液吸光度不斷下降,10 min后,吸光度不再改變(圖2)。取破碎10 min的菌液鏡檢,細菌失去正常的形態,活性喪失(圖3)。

圖2　細菌破碎

圖3　破碎10 min后的細菌 (100×)

3.3小鼠生長性能 與空白組相比,細菌上清組、日增重顯著下降(P＜0.05),破碎組日增重極顯著下降(P＜0.01),如圖4所示。細菌上清組、破碎組及懸液組日采食量與空白組相比均有所下降,但統計學上無顯著性差異(P＞0.05)(圖5)。

3.4臟器指數的測定 與空白組相比,細菌上清組、破碎組、懸液組肺臟指數極顯著升高(P＜0.01),脾臟指數極顯著下降 (P＜0.01),肝臟、胸腺指數無顯著變化(P＞0.05)(圖6)。

圖4　小鼠日增重

圖5　小鼠日采食量

圖6　臟器指數

3.5IL-6及TNF-α的水平 空白、上清、破碎、懸液4組中,大部分小鼠血清中 IL-6均在0～20 pg/mL之間,而破碎和懸液兩組中極少數的小鼠血清中IL-6含量在20 pg/mL以上,但均無顯著差異(P＞0.05)(圖7)。上清、破碎、懸液3組中小鼠血清中TNF-α較穩定,與空白組比均無差異(P＞0.05),無統計學意義(圖8)。

圖7　小鼠血清IL-6水平

圖8　小鼠血清TNF-α水平

4　討論與結論

在感染過程中,為對抗機體的免疫系統,細菌會在不同的時期表達不同的毒力因子,在這些毒力因子中發揮主要作用的就是細菌毒素[1],包括外毒素和內毒素。外毒素是大部分病原菌在代謝過程中分泌到菌體外的蛋白質,細菌產生的外毒素對組織的毒性作用有高度的選擇性,各自引起特殊的臨床癥狀。內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁的組成成分,其主要化學成分為脂多糖[2],不同病原菌所產生的內毒素引起的癥狀大致相同,都能引起機體體溫升高、腹瀉和出現出血性休克和其他癥狀[3-5]。但利用毒素建立生長遲緩模型的研究鮮有報道,因此,本試驗研究嘗試采用灌服細菌培養上清液及破碎液的方法來建立小鼠生長遲緩模型。

細菌外毒素在生長繁殖的過程中分泌到菌體外,但也有少數則存在菌體內,當細菌裂解后釋放到菌體外。內毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌體后才釋放出來。因此,只有破碎細菌才能獲得高濃度的細菌毒素。通過對K99生長曲線的測定可知,16～20 h是該菌生長的平臺期,22 h時活菌數達到最大,此時,細菌毒素產生的速率最大,24 h時,活菌數顯著下降,其可說明在24 h時產生的毒素是最多的,因此選擇此時進行細菌破碎可獲得最大的毒素濃度。張帥[6]報道采用微波法、珠磨法、超聲波法、反復凍融法、石英砂研磨法分別對嗜酸乳桿菌進行細胞破碎分離細菌毒素,結果表明超聲波破碎法細胞破碎效果最好。本試驗采取超聲破碎的方法進行細菌破碎,隨著超聲時間的延長,探頭溫度上升,易破壞細菌外毒素,因此我們選擇工作5 s,間隔5 s,而且將菌液放入冰上以維持低溫。隨著破碎時間的延長,OD值成依賴性下降,破碎10 min時,OD值達到最低,取菌液進行革蘭染色,菌體失去原有的形態,說明細菌已完全破碎。

盡管細菌的外毒素和內毒素在結構性質和作用機制上完全不同,但都能不同程度地對機體產生嚴重損害。體重是衡量小鼠生長發育的一項重要指標。本試驗研究結果顯示,細菌上清組日增重與空白組相比顯著下降;破碎組、懸液組日增重與空白組相比極顯著下降,其說明細菌毒素能夠使小鼠生長遲緩,模型建立成功。動物的臟器指數是重要的生物學特性指標之一,其數值大小可以在一定程度上反映機體的功能狀態。前期有報道[7]表明,口服嘔吐毒素組和各聯合毒素組小鼠增重顯著低于對照組(P＜0.05);嘔吐毒素組、煙曲霉素B1組和各聯合毒素組小鼠脾臟和胸腺指數顯著低于對照組(P＜0.05)。細菌毒素可能會通過影響機體器官功能狀態,進而造成動物的生長遲緩。本試驗結果發現,細菌上清組、破碎組、懸液組對脾臟指數的影響差異均顯著。

內毒素可以激活在上皮細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞上的Toll樣受體4,然后通過骨髓分化初級反應基因88(MyD88)依賴途徑激活NF-κB,釋放IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子[8]。IL-6可通過誘導纖維蛋白原啟動凝血因子,在腸道黏膜異常堆積,使炎癥反應不斷加重[9]。TNF-α可在受損的腸黏膜中大量表達,并且其病變范圍越大、病變越嚴重,TNF-α水平越高[10]。我們猜測,口服細菌毒素會導致腸黏膜發生炎癥反應,進而影響生長性能。因此,我們通過檢測IL-6、TNF-α的水平來驗證口服細菌毒素是否會造成小鼠炎癥反應。結果表明,通過灌服細菌毒素的方式對大部分小鼠不會引起炎性反應。此外,Dutch Committee on Occupational Standards證實:口服LPS對健康的人群只會造成微弱的傷害[11]。因此,我們推測造成小鼠生長遲緩的原因并不是毒素進入機體引起炎癥反應造成的。本研究中極少數小鼠血清IL-6水平升高可能是個體腸道機能減退造成的。

近半個世紀以來,抗生素作為抗菌助長劑添加到飼料中,對控制畜禽疾病的發生,促進畜禽生長發育,提高飼養效益確實起到積極的作用。目前,抗生素促生長的機理尚不明確。傳統的觀點認為抗生素的各種作用效果都是基于抗生素對腸道微生物的直接作用。Niewold則認為抗生素具有促生長的作用可能是其抑制動物腸道的炎癥反應[12]。我們認為飼料在儲存過程中,易滋生細菌,產生大量的細菌毒素,其是引起動物生長遲緩的主要原因,飼用抗生素主要通過抑制有害病原微生物的增殖及活性,進而減少毒素的釋放量,起到促動物生長的效果。本試驗中細菌破碎液和細菌懸液均能極顯著降低小鼠體重,說明細菌可通過產生毒素抑制動物生長。但是,長期、大量地使用抗生素可能會使病原菌產生耐藥性[13]等多種副作用。因此,世界各國陸續開始限制或禁止將抗生素添加在飼料里[14]。中藥具有天然性、毒副作用小、無殘留和無耐藥性等獨特優勢[15-16],可作為抗菌和促生長的飼料添加劑,具有廣闊的開發前景。目前,在代替抗生素的中藥飼料添加劑開發研究領域,尚缺乏統一的動物模型。本研究中建立的小鼠生長遲緩模型,可為該領域提供穩定可靠的實驗動物模型,促進中藥添加劑的研究發展,也可為相關模型建立與發展提供一定的參考。

本研究通過灌服細菌毒素成功建立了小鼠生長遲緩模型,為研究替代抗生素飼料添加劑提供了動物模型,但是本研究還存在很多不足。本試驗采用大腸桿菌K99上清及破碎均是小鼠日增重顯著下降,但是其產生的毒素種類復雜,尚不清楚是那一種毒素還是幾種毒素聯合導致小鼠生長遲緩,還需進一步研究。灌服毒素抑制生長的機制還不清楚,其機理還需深入研究,通過本試驗初步確定與炎性因子IL-6、TNF-α水平升高無關。

本研究表明,成功建立了灌服細菌毒素導致小鼠生長遲緩的模型,可為開發具有滅活細菌毒素的中藥添加劑提供動物模型。

參考文獻: