納米金團簇經滴鼻途徑暴露急性毒性評價

陽 月,劉天龍,張瑩瑩,孫振寧,王自力

(1.西南大學動物科技學院 ,重慶 北碚 400700;2.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

納米金團簇是指在一定的分子層保護下,由幾個到幾百個金原子組成的相對穩定的聚集體。由于其具有尺寸小、光穩定好、制備條件溫和等突出的優點,納米金團簇在熒光成像、生物檢測、食品安全檢測等領域展現出極大的應用前景[1-4]。隨著應用的增多,納米金團簇潛在的生物毒性問題也逐漸引起人們的重視,但相關毒性研究仍非常少。本文首次評價了納米金團簇經滴鼻暴露對小鼠的急性毒性作用,為納米金團簇的生物應用提供毒理學實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗動物 雌性ICR小鼠60只,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,6～8周齡,體重20～22 g,隨機分為4組,每組15只。

1.2納米金團簇的制備及表征 根據Liu.X等[5]的方法來制備熒光納米金團簇。稱取2 g BSA攪拌溶解于40 mL去離子水中,滴加40 mL 10 mmol/L氯金酸,隨后置于37℃孵育30 min,后用1 mol/L NaOH溶液將混合溶液的pH值調至12,置于37℃過夜。然后在去離子水中透析48 h除去未反應完全的金離子。制備好的納米金團簇于Hitachi S-4300電子顯微鏡下進行拍照,并對其熒光吸收強度進行測量。

鉤藤灰霉病可用0.5%小檗堿水劑200～500倍，或3億CFU/克哈茨木霉菌20～50倍，或10億個/克枯草芽孢桿菌800～1 000倍，或40%嘧霉胺懸浮劑1 000～1 500倍，或50%異菌脲懸浮劑1 000～1 500倍噴霧或煙霧。

1.3動物模型與樣品采集 將納米金團簇溶液用PBS 稀釋配制 1、0.2、0.1 mg/mL 溶液,小鼠肌肉注射0.1 mL 1%戊巴比妥鈉溶液麻醉,滴鼻50 μL的不同濃度的納米金團簇溶液。滴鼻后的1 d、5 d,14 d各組隨機選取5只小鼠,眼內眥靜脈采血進行血常規檢測,另摘除眼球取血,分離血清進行血生化指標檢測。取小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦組織,4%中性甲醛溶液固定,取部分組織制作冰凍切片進行熒光信號觀察。

1.4血液學分析 采取抗凝血進行血常規檢測,指標為紅細胞比容(HCT)、血紅蛋白數(HGB)、平均紅細胞血紅蛋白量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)、紅細胞平均體積(MCV)、血小板數(PLT)、紅細胞數(RBC)、白細胞數(WBC)。采集血清進行血生化指標檢測,指標為ALT,AST,BUN和CREA。

1.5組織切片 經甲醛固定液充分固定的小鼠組織,依常規程序制作石蠟切片,H.E.染色,顯微鏡下觀察組織形態學變化。

1.6體內分布 各組織冰凍切片置熒光顯微鏡下觀察,激發波長為,納米金團簇為紅色熒光,檢測各組織中熒光信號強度和分布。

1.7數據處理 所用數據均用SPSS 16軟件進行統計處理,均以平均值±標準差表示,并對各組數據進行方差分析,以P＜0.05表示顯著性差異。

2　結果

2.1納米金團簇的表征 納米金團簇溶液澄清,淺黃色,分散良好,在紫外光下呈紅色熒光,見中插彩版圖1A,發射波長為650 nm。在電鏡下,納米金團簇大小為1～3 nm,顆粒均勻,單分散,如中插彩版圖1B所示。

2.2小鼠存活率及體重變化 小鼠滴鼻暴露后無明顯臨床變化,實驗結束前未出現死亡動物,與對照組相比,各染毒組小鼠的體重無明顯變化,1 mg/kg·bw組小鼠體增重低于對照組,但差異不顯著。

表1　各實驗組不同時間點血常規白細胞數量結果

2.3血液學結果 除白細胞數外,染毒組小鼠其他血常規指標均與對照組無明顯差異。如表1所示,1 mg/kg·bw劑量染毒組的白細胞數1 d時明顯高出對照組,但在5 d時有下降趨勢,隨后又在14 d時達到最高,差異極顯著。其他兩個劑量組與對照組相比各指標無明顯差別。

表2　各實驗組不同時間點ALT含量結果

如表2和表3所示,1 mg/kg·bw劑量染毒組的谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)指標明顯高于對照組,且隨著時間的延長而升高。各劑量染毒組血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)與對照組相比無明顯差異。

表3　各實驗組不同時間點AST含量結果

2.4組織化學結果 分別對心、肝、脾、肺、腎、腦組織進行了H.E.染色,鏡下觀察結果發現,染毒組小鼠的腦、腎、心、脾組織均無明顯病變出現。1 mg/kg·bw劑量染毒組小鼠肺臟可見出血,肺泡隔增寬,肺泡內有少量炎性細胞,如中插彩版圖2B黑色箭頭所示,染毒組在小鼠的肝組織中有散在炎性灶,如中插彩版圖2D黑色箭頭所示,肝細胞腫脹變性。中插彩版圖2A為對照組肺臟,中插彩版圖2C為對照組肝臟。

2.5金團簇體內分布結果 熒光顯微鏡檢測結果表明,在肝臟和肺臟中可見紅色熒光顆粒,其他臟器未觀察到紅色熒光顆粒存在,說明金團簇經滴鼻暴露后主要分布于肺臟與肝臟,這與血生化指標結果和組織形態學結果一致。

3　討論

隨著納米技術的迅猛發展,納米級產品的應用越來越多,但納米材料的生物安全性問題一直未得到解決。納米金團簇作為一種新型的熒光納米材料近年來在生物檢測、食品安全檢測方面表現出巨大的應用前景,但隨著其應用的增多,人們接觸該納米級材料的可能性也增大,其潛在的生物毒性成為制約其進一步發展的瓶頸問題。本試驗通過滴鼻的方式給小鼠暴露納米金團簇,通過血液學檢測,組織形態學觀察來評價納米金團簇對小鼠的毒性作用。血常規數據表明了染毒組的WBC明顯高于對照組,說明納米金團簇可以引起小鼠體內的急性炎癥反應;血生化指標數據表明,染毒組的ALT和AST明顯高于對照組,而BUN和CREA無明顯差異,說明了納米金團簇對小鼠的肝功能造成一定損傷,而對腎功能無明顯影響。組織形態學觀察發現,小鼠的肝、肺組織均出現炎癥,而其他組織未觀察到明顯病變。這些結果說明了納米金團簇以滴鼻的途徑暴露后主要靶向器官為肝臟和肺臟。體內分布結果顯示,在肺臟和肝臟發現紅色熒光信號,說明經滴鼻吸入的納米金團簇主要分布于肺臟和肝臟,這與組織形態學觀察得到的結果相一致,提示納米金團簇可能通過肺臟進入血液循環中,隨后被肝臟中的單核巨噬細胞系統所捕獲。本文研究為納米金團簇在生物學方面的應用提供了必要的毒理學數據支持。