阿莫西林和硫酸黏菌素對奶牛乳房炎病原菌的體外抑菌試驗

楊 幸,陳婷婷,肖希龍

(中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

奶牛乳房炎是一種常見的疾病,對全球乳制品行業具有重要意義,它關系到巨大的經濟損失和患病奶牛的福利問題,主要是由病原微生物感染所致,最常見的病原菌為大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和綠膿桿菌等。目前,奶牛乳房炎的臨床治療仍以抗生素為主,常用藥物以β-內酰胺類為主,如阿莫西林、氨芐西林等。但是,隨著抗生素的濫用、臨床菌株的變異以及病原菌的多樣性,越來越多的病原體出現對抗生素的多重耐藥,因此,聯合用藥成為更好的選擇。阿莫西林(Amoxicillin)是β內酰胺類抗生素,具有高效、廣譜、低毒的特點,廣泛用于獸醫臨床,對革蘭陰性菌和陽性菌均有較強而迅速的殺菌作用,對溶血性鏈球菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌、白喉桿菌、淋球菌、流感桿菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌等均有較強的抗菌作用[1]。硫酸黏菌素(Colistin Sulfate)是多肽類抗生素,主要對綠膿桿菌、大腸桿菌等大部分革蘭陰性桿菌有抗菌作用,局部用藥可用于敏感菌引起的牛乳腺炎、子宮炎等[2]。近年來,阿莫西林和硫酸黏菌素聯合用藥已有報道,且本實驗室前期已成功研制出用于治療豬呼吸道疾病的阿莫西林/硫酸黏菌素復方制劑。本試驗旨在通過考察阿莫西林與硫酸黏菌素對奶牛乳房炎病原菌的體外抗菌活性,以期為該制劑合理應用于治療奶牛乳房炎提供科學依據。

1　材料

1.1供試藥品 阿莫西林:含量86.9%,中國藥品生物制品檢定所(批號:130409-201512);硫酸黏菌素:含量98%,北京偶合科技有限公司(批號:1264-72-8)。

1.2供試菌株 大腸桿菌55株(山東濟南)、金黃色葡萄球菌71株(內蒙古)、鏈球菌13株(山東濟南)(系臨床分離致病菌);質控菌 ATCC25922、ATCC29213,均為中國農業大學藥理與毒理教研室提供。

1.3培養基 MH肉湯、MH瓊脂、KF瓊脂、麥康凱瓊脂、科馬嘉瓊脂、小牛血清(供鏈球菌培養用)。

2　方法

2.1藥物儲備液的制備及保存 AMO儲備液 用pH值6.0,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并定容,配制終濃度為1 280 μg/mL,分裝至2 mL滅菌EP管中,密封于-20℃冰箱保存,有效期為1個月;COS儲備液用超純水溶解并定容,配制終濃度為2 560 μg/mL,分裝至2 mL滅菌EP管中,密封于-20℃冰箱保存,有效期為3個月。

2.2菌液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及鏈球菌保種菌液經復蘇后分別涂布至麥康凱培養基、科馬嘉培養基及KF培養基,經鑒別后確認。各自挑取同一平板上性狀相似的1～2個菌落,肉湯增菌培養后涂布至MH培養基,接著挑取MH培養基中單個菌落,接種至1 mL MH肉湯(鏈球菌培養需加入5%小牛血清)中,于37℃下,大腸桿菌靜置培養6～8 h,金黃色葡萄球菌振蕩培養6～8 h,鏈球菌振蕩培養10～12 h,稀釋至試驗所要求的1×106CFU/mL。

2.3藥物儲備液的稀釋 參照CLSI提供的藥物敏感性范圍及已發表文獻報道的阿莫西林和硫酸黏菌素對上述3種細菌的MIC值,確定藥物的稀釋終濃度。稀釋液為MH肉湯。

2.4單藥最低抑菌濃度(MIC)測定 參照CLSI抗生素藥敏試驗中的微量稀釋法,采用96孔(12×8)U型稀釋板對藥物進行無菌操作,1～10孔從高濃度至低濃度倍比稀釋,A-H共8排分4組,每組測1株菌,第11孔為有菌無藥陽性對照,第12孔為無菌無藥陰性對照。密封后將96孔板置于37℃恒溫培養箱內,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養16～20 h、鏈球菌培養20～24 h后觀察記錄結果,試驗重復3次。

2.5聯合藥敏試驗 采用棋盤稀釋法8×8,以各菌株單藥MIC值確定稀釋濃度,最高濃度為MIC值的2倍,設6個稀釋濃度,依次倍比稀釋為1、1/2、1/4、1/8、1/16濃度,兩種藥物在96孔 U型稀釋板上按照橫向和縱向進行聯合,G1和H1孔作為無菌無藥陰性對照,G2和H2孔作為有菌無藥陽性對照。接種菌量為1×106CFU/mL,密封后將96孔板置于37℃恒溫培養箱內,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養16～20 h、鏈球菌培養20～24 h后觀察并記錄結果。

2.6結果判定

2.6.1MIC結果判定 在有黑色背景的光源下觀察,有菌生長的底部有沉淀,當質控菌MIC在范圍內,陽性對照孔內細菌明顯生長,陰性對照孔內未見細菌生長時,無菌生長孔所含最低藥物濃度即為該菌株MIC。如出現多處跳孔,則結果無效,需重復試驗。

2.6.2FIC 結果判定

協同作用:FIC≤0.5;相加作用:0.5 ＜FIC≤1;無關作用:1＜FIC≤2;拮抗作用:FIC＞2。

3　結果與分析

3.1阿莫西林和硫酸黏菌素單用的MIC結果 兩藥臨床分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌(共139株)的藥敏試驗結果見表1,表中結果顯示,阿莫西林對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的 MIC 范圍分別為 2.0 ～ 128.0 μg/mL、0.125 ～128.0 μg/mL 和0.125 ～1.0 μg/mL;硫酸黏菌素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及鏈球菌的MIC范圍分別為 0.5 ～ 8.0 μg/mL、32.0 ～ 128.0 μg/mL 和64.0 ～1 024.0 μg/mL。 阿莫西林對無乳及停乳鏈球菌高度敏感;對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌適度敏感;硫酸黏菌素對引起奶牛乳房炎的大腸桿菌表現出較高的敏感性,對金黃色葡萄球菌、鏈球菌的敏感性較低。

表1　阿莫西林和硫酸黏菌素對3種細菌的MIC及對應菌株數

3.2阿莫西林和硫酸黏菌素聯合藥敏試驗結果選擇部分已完成藥敏試驗的臨床菌株(共20株)進行聯合藥敏試驗,結果見表2和表3。結果表明,阿莫西林和硫酸黏菌素聯用后,對20株奶牛乳房炎大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均無拮抗作用,呈協同與相加作用比例為60%,呈無關作用比例為40%。二者聯用對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌FIC平均值分別為0.91、0.85、1.25,對所有菌株的FIC平均值為0.93。這表明,阿莫西林和硫酸黏菌素聯用后對3種受試菌主要呈現相加作用。

4　討論

獸醫臨床中,阿莫西林為繁殖期殺菌劑(Ⅰ類),可破壞細胞壁的完整性,是治療鏈球菌、金黃色葡萄球菌等革蘭陽性菌的常用藥物,硫酸黏菌素為靜止期殺菌劑(Ⅱ類),主要影響細胞膜的通透性,常用于治療大腸桿菌、綠膿桿菌等革蘭陰性菌感染。阿莫西林硫酸黏菌素聯用,不僅擴大抗菌譜,有利于治療臨床上的多種病原體感染,且通過不同抗菌機制,發揮二者的協同抗菌作用。

表2　阿莫西林和硫酸黏菌素對3種細菌的MIC和FIC

表3　阿莫西林和硫酸黏菌素聯合效果

國內外已有報道,關于阿莫西林或硫酸黏菌素與其他藥物聯合應用。阿莫西林與阿米卡星[3]具協同作用、與硫酸黏菌素[4-6]以協同和相加作用為主、克拉維酸鉀[7]、與舒巴坦鈉[8]有協同作用,聯用均具有較強的抗菌活性;硫酸黏菌素與恩諾沙星[9]、硫酸黃連素[10]等多種藥物聯用具有協同作用。牟曉燕[11]等用阿莫西林鈉與地塞米松治療奶牛急性乳房炎效果顯著。

本實驗室李蘭等[5]前期研究了阿莫西林與硫酸黏菌素對57株供試菌聯合抗菌活性,結果顯示,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、鏈球菌和巴氏桿菌的體外抗菌作用以協同和相加作用為主,占比92.98%;呈無關作用比例為7.02%,無拮抗作用。在本試驗中,阿莫西林和硫酸黏菌素聯用后,對奶牛乳房炎臨床菌株的協同和或相加作用比例略有下降,可能是由于臨床菌株樣本數較少、不同動物源的菌株差異以及近年來細菌耐藥性嚴重造成的,這將有待進一步研究。

綜上所述,阿莫西林和硫酸黏菌素聯用后,對奶牛乳房炎臨床菌株主要呈相加或協同作用,具有擴大抗菌譜、減少藥物劑量、降低細菌耐藥率的發生等優勢,能有效防治多種病原菌引起的奶牛乳房炎,可為獸醫臨床上有關奶牛乳房炎制劑的研制及治療提供合理的科學依據。

參考文獻: