鼠傷寒沙門菌人工感染鵝的病理組織學觀察

劉敏芳,曹夢蕊,李榮旭,盧玉葵,陳建紅,陳 煢,許文燁,張濟培

(佛山科學技術學院生命科學院,廣東 佛山 528231)

沙門菌(Salmonella)是腸桿菌科沙門菌屬中一種重要的食源性人獸共患病病原菌。能在人和動物間交叉感染,可致人和動物急性食物中毒、急性胃腸炎、菌血癥和腸外感染等疾病,在醫學、獸醫學、公共衛生學方面有重要意義[1-2]。一般認為,該病主要危害3周齡以內的雛鵝,使之發生敗血癥、胃腸炎及其他組織局部炎癥的急性感染,在中、成年鵝群呈慢性及隱性感染,無明顯的臨床表征且不致死[3]。近年來,沙門菌危害鵝群的日齡越來越大,可引起成年鵝群生產性能下降并出現急性死亡。有數據表明,鼠傷寒沙門菌是家禽感染沙門菌病的優勢血清型之一,與其他家禽相比,鵝更容易受到鼠傷寒沙門菌的感染,并且對鼠傷寒沙門菌的抗性隨著年齡的增加而增加[4-5]。因此,本試驗以鼠傷寒沙門菌人工感染8周齡的中年鵝群,對受感染鵝進行臨床癥狀、病理剖檢觀察及顯微病理組織學觀察,初步了解鼠傷寒沙門菌對鵝機體的影響,為臨床診斷鵝沙門菌病及有效防控該病提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株來源 源于廣東佛山三水某鵝場病鵝,分離純化鑒定為鼠傷寒沙門菌(O1,O4,O12;Hi;H1,H2)分離株(下簡稱SESM株),甘油凍存備用。

1.2試驗動物 1日齡購自非疫區的健康鵝12只,飼養至8周齡,攻毒試驗前采集肛拭子進行沙門菌分離鑒定,結果為陰性。

1.3主要試劑與設備 丹麥SSI沙門菌診斷血清(廣州迪景生物有限公司);LB肉湯、RVS增菌肉湯、XLD培養基與沙門菌生化鑒定盒(廣東環凱生物技術有限公司);T-cycles PCR儀、凝膠成像系統(Bio-Rad公司產品)。

1.4菌懸液的制備 釣取SESM株單個菌落,接種于8 mL LB液體培養基中,37℃,200 r/min,培養20 h,制備濃度約為5×107CFU/mL的菌懸液。

1.5動物分組處理 隨機將8周齡試驗鵝分為試驗組與對照組,每組6只。試驗組每只鵝經肌肉注射鼠傷寒沙門菌懸液各0.5 mL,對照組每只鵝肌肉注射生理鹽水各0.5 mL,隔離飼養。

1.6動物觀察與病料處理 連續觀察14 d,記錄鵝的精神狀況、食欲、活動、糞便等臨床變化以及發病和死亡情況,并對感染發病鵝進行細菌的分離鑒定,觀察主要組織器官的病理變化,并采取其病變的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺和腸道放置于10%甲醛溶液固定液固定48 h以上,制作病理組織石蠟切片,觀察組織學病理變化。

我們知道，無論哪一種中波發射天線，對于不同的工作頻率，其輸入阻抗是不同的，如果在天線饋點上的阻抗差異太大，會給共塔網絡的設計帶來困難，因此，必須在兩個或多個共塔頻率的饋點上加裝平衡網絡——預調網絡，預調網不僅能夠平衡饋點上各頻率的阻抗，還能起到防雷和減少功率損耗的作用，因此也就減小了網絡設計難度。圖1中L0、C0是兩個預調網絡元件。

2　結果

2.1人工感染鵝的臨床癥狀 試驗鵝感染6 h后開始精神沉郁,扎堆,拉白色稀糞(見中插彩版圖1);12 h后出現以震顫為主的神經紊亂癥狀,食欲減退甚至廢絕,羽毛潮濕,軟腳及繼續拉水樣白色稀糞;18 h后開始出現死亡,于48 h內死亡4只鵝;5 d后2只存活鵝明顯消瘦,但精神食欲好轉,逐步恢復正常;對照組動物無感染發病與死亡情況。

2.2人工感染鵝的病理變化 發病鵝的剖檢病理變化均為皮下肌肉呈彌漫性出血,氣囊壁渾濁,呈樹枝狀充血(見中插彩版圖2);心外膜充血、心肌可見芝麻大小的出血斑點(見中插彩版圖3);肝可見充血與針尖狀出血點,表面有大量不規則的灰白色雪花狀壞死灶(見中插彩版圖4);膽汁充盈、呈墨綠色濃稠樣;脾臟腫大,呈暗紅色充血,可見芝麻大小的灰白色壞死點;肺輕微出血、水腫;腎臟腫大,呈暗紅色斑塊狀出血;腦組織輕微腫脹,可見少量組織液滲出,呈樹枝狀充血(見中插彩版圖5);胰腺腫大、表面布滿針尖狀出血點;腸系膜脂肪可見芝麻大小的出血斑;消化道黏膜以彌漫性充血、出血為主,腺胃乳頭可見多量出血斑點、肌胃角質層易剝離,腸道內充滿粥樣內容物,十二指腸與空腸黏膜彌漫性出血呈紅布樣(見中插彩版圖6),回腸黏膜彌漫性出血,淋巴結腫大、出血,盲腸與直腸黏膜彌漫性出血較輕,卵巢與睪丸充血、出血等。對照組鵝剖檢未見眼觀異常。

2.3人工感染鵝的病理組織學觀察 顯微組織學觀察可見,感染鵝的心臟、肝、脾、肺、腎、腦、胰腺和腸道等組織與細胞均有不同程度的充血與出血、變性與壞死。心肌纖維排列紊亂、甚至斷裂,心肌纖維間可見大量紅細胞和炎性細胞(見中插彩版圖7)。肝細胞變性、細胞質可見大小不一的空泡,部分肝細胞壞死形成大小不一的壞死灶,壞死灶內可見淋巴細胞、異嗜性粒細胞與壞死崩解肝細胞(見中插彩版圖8);肝血竇擴張、充滿紅細胞;門管區可見多量淋巴細胞和異嗜性粒細胞(見中插彩版圖9)。脾白髓結構疏松,網狀細胞數量增多,淋巴細胞變性壞死、數量減少、可見大量的核碎片及細胞殘留的支架并可見少量紅細胞(見中插彩版圖10);紅髓堆積多量紅細胞、網狀細胞數量增多。三級支氣管、肺房、肺毛細血管、肺間質可見少量紅細胞與少量炎性細胞浸潤。腎小管上皮細胞腫脹、變性壞死,腎間質可見多量紅細胞;腎小球充滿紅細胞;腎間質可見大量紅細胞浸潤(見中插彩版圖11)。腦充血、水腫、毛細血管與小靜脈擴張充血、周圍間隙明顯增寬(見中插彩版圖12);部分神經元變性壞死,可見噬神經元現象,血管擴張充血、形成淋巴細胞管套(見中插彩版圖13);胰腺的胰島細胞數量減少、部分細胞胞核固縮、變性壞死,間隙有大量紅細胞浸潤;腸黏膜上皮細胞變性壞死、大量脫落,固有層、黏膜下層、肌層可見大量紅細胞和以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤(見中插彩版圖14)。

對照組鵝心肌纖維呈螺旋狀排列,可見縱、橫、斜等不同切面,縱切面可見橫紋和閏盤;肝組織的肝小葉分界不清,肝細胞呈錐體形,細胞核大而圓,肝血竇中有個別紅細胞;脾白髓由密集的淋巴細胞環繞動脈組成,呈圓形、藍紫色和致密淋巴組織團塊,散布于紅髓中。三級支氣管、肺房中無漿液、紅細胞等雜質,肺房呈不規則空囊腔;腎小管由立方形或錐體形上皮細胞組成,胞質強嗜酸性,細胞界限不清;神經元胞核大而圓、著色淡,有多個樹突;空腸黏膜絨毛完整,皺襞發達,指狀、杯狀細胞多,固有層有少量孤立淋巴小結;胰腺的胰島細胞排列成團索狀,細胞之間有豐富的毛細血管。

2.4分離鑒定結果 將分離的6株分離株培養物進行生化鑒定、血清型鑒定、PCR鑒定。生化鑒定結果符合沙門菌的生化特性;血清型分型為鼠傷寒沙門菌(O1,O4,O12;Hi;H1,H2);PCR鑒定根據invE基因設計引物,條帶大小約為279 bp。結果顯示SESM株、分離株與預期片段一致(圖15)。

圖15　SESM株、分離株的invE基因PCR擴增結果

3　分析與討論

沙門菌病是危害養殖業的主要病原菌之一。目前對于禽類(雞、鴨、鵝),已有的沙門菌如雞白痢沙門菌、腸炎沙門菌、鴨沙門菌等感染的病理組織學變化的報道,但鵝群感染鼠傷寒沙門菌引起的顯微病理組織學變化鮮有報道[6]。不同沙門菌血清型引起動物體的癥狀與病變并不完全一致,受感染動物的主要臟器的病理組織學變化也應各有其特點,故很有必要加以研究分析鵝群感染鼠傷寒沙門菌模型,以進一步明確其致病危害性質,豐富診斷理論依據。

本試驗結果明確了鵝感染鼠傷寒沙門菌的癥狀與危害。可見被感染鵝拉水樣白色稀糞、消瘦、震顫等臨床癥狀,表明鼠傷寒沙門菌可侵害消化道與中樞神經,并影響機體的生長發育,這與成建[7]、金海林[8]等人的關于雛鵝沙門菌病的臨床癥狀報道基本一致。試驗鵝感染6 h后開始出現臨床癥狀,18 h后出現死亡,與顏彬[9]試驗中的腸炎沙門菌人工感染鴨24 h才出現臨床癥狀,72 h開始出現死亡的結果有所區別,與曾靜靜[6]試驗中的鴨沙門菌人工感染鴨7 d均未死亡的結果亦有所區別,說明不同沙門菌血清型引起動物體的感染、致死性并不完全一致,鼠傷寒沙門菌是強致病性沙門菌,對水禽的危害更大。

本試驗結果明確了鵝感染鼠傷寒沙門菌的大體組織學變化。光學顯微鏡下可見感染鵝心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦與腸道等多組織器官大量紅細胞和以異嗜性粒細胞、淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤,實質細胞變性壞死,并以消化器官的細胞損傷最為嚴重。這些顯微病理組織學變化與剖檢中充血、出血、壞死等病變特征密切相關。Barbosa[12]的研究發現,沙門菌可引起雞多組織器官不同時期的淋巴樣反應,尤其是肝臟與腸道的淋巴樣反應更為強烈,解釋了炎性細胞浸潤的現象。

由上述感染模型推測,鼠傷寒沙門菌感染鵝的病理過程與機理為:病原經肌肉注射進入組織,通過組織液進入毛細血管網與淋巴液中,發病早期引起菌血癥,主要侵害消化道引起局部微絨毛細胞變性、黏膜固有層充血、水腫和點狀出血等腸道炎癥反應;隨著血液循環快速繁殖并產生大量毒素,進入肝臟、肺臟、脾臟、腎臟等組織器官造成不同程度地病理損傷及其細胞變性壞死引發敗血癥,并突破血腦屏障進入中樞神經引起神經癥狀,最終引起鵝的死亡。鼠傷寒沙門菌感染鵝群后,既可垂直傳播也可水平傳播,加之鵝群“水陸”結合的高密度養殖模式,使防控更為困難,給養鵝業帶來嚴重的經濟損失;同時本病原對公共衛生安全也具有潛在的危害,威脅人類的健康,建議進一步加強研究與診斷防控。