炎癥刺激對新生仔豬鐵含量 血清生化指標及Hepcidin基因表達量的影響

李夢云,梁曉曉,段新安,聶芙蓉,哈斯通拉嘎,李婉濤

(1.河南牧業經濟學院飼料工程中心,河南 鄭州 450011;2.河南廣安生物科技股份有限公司,河南 鄭州 450001;3.河北省曲周縣畜牧局,河北 曲周 057250)

鐵調素(Hepcidin)是一種由肝臟分泌的含半胱氨酸的陽離子抗菌肽[1],可通過抑制小腸鐵吸收、單核巨噬細胞系統鐵釋放來調節鐵吸收,從而維持機體鐵平衡[2],因而可通過調控Hepcidin基因表達量來調控機體鐵吸收。小鼠和大鼠上的研究表明,飼糧鐵過量和炎癥可誘導Hepcidin的生成[3],貧血和缺氧則抑制其表達量[4]。但在豬體內特別是在新生仔豬體內關于Hepcidin mRNA表達量調控的研究較少,因此有必要進行這方面的研究。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分,能釋放出內毒素,常用于構建動物炎癥刺激模型。本試驗擬通過對新生仔豬注射LPS,并通過實時熒光定量PCR方法,探討炎癥刺激對仔豬Hepcidin mRNA表達量的影響,為研究炎癥刺激、機體鐵含量及Hepcidin mRNA表達量之間的關系提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1試驗設計與試驗動物 挑選剛出生健壯的平均體重為(1.36±0.18)kg杜長大三元雜交仔豬10頭,隨機分為2組,即對照組和脂多糖刺激組,每組5個重復,每個重復1頭豬。炎癥刺激組分別于3日齡、5日齡和7日齡時腹腔注射LPS(Sigma公司)1 mL/kg(含 LPS 100 μg/kg·bw),建立炎癥應激模型。對照組仔豬分別在相同日齡注射相同體積生理鹽水。7日齡時,將所有仔豬全部處死,采集血清,并分離肝臟和脾臟,測定血液生化指標、機體鐵含量和肝臟中抗菌肽基因Hepcidin mRNA表達量。

1.2樣品采集與處理

1.2.1血清取樣 7日齡時,屠宰后采血10 mL,3 000 r/min離心15 min,取上清液-20℃保存,用于血液指標及血清鐵含量的測定。

1.2.2肝臟、脾臟取樣 屠宰仔豬后快速取仔豬右側肝臟2 g左右,剪碎后裝入無RNA酶1.5 mL EP管中,迅速在液氮中冷凍,-70℃保存,用于提取總RNA。并盡快采集肝臟、脾臟樣品10 g,-20℃保存,用于測肝臟、脾臟中鐵含量。

1.3測定指標與方法

1.3.1肝臟、脾臟和血清中鐵含量的測定 準確稱取0.2 g肝臟、脾臟樣品,采用Z-2000系列原子吸收分光光度計測定肝臟、脾臟和血清中鐵含量。

1.3.2血清生化指標的測定 所有血清指標均送往鄭州市第五人民醫院檢驗科測定。

1.3.3肝臟中Hepcidin mRNA表達量的測定 每個重復取30 mg肝臟樣品在液氮并研磨成粉,收集于1.5 mL Eppendorf管中,用RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司,SK1312)提取總RNA,具體過程按試劑盒操作說明書進行。將提取的總RNA作為模板,用cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司,SK2445)進行RT反應。 反應體系:總 RNA 5 μL、Oligo dT 引物1 μL、RNA 酶抑制劑 1.0 μL、dNTP Mixture 2 μL、5 × RT緩沖液 4 μL、反轉錄酶 2 μL、無 RNA 酶去離子水5 μL。 按70 ℃ 5 min、冰浴10 s、37 ℃ 5 min、42 ℃60 min、70℃ 10 min程序在 Mastercycler Gradient PCR儀中進行RT反應。

Hepcidin基因(AF516143)和內參基因β-actin(AY550069)引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,各基因引物序列如下:Hepcidin-F:5′-TCCGTTCTCCCATCCCAGAC-3′、Hepcidin-R:5′-GCAGCACATCCCACAGATTG-3′;β-actin-F:5′-TGCGGGACATCAAGGAGAAG-3′、β-actin-R:5′-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGG-3′。定量 PCR反應體系總體積為20 μL,反應體系如下:cDNA 2 μL、SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(10 μlmol/L)各 1μL、0.1%DEPC 處理水 6 μL。 定量PCR反應程序如下:95℃ 3 min,95℃ 30 s共40個循環,最后70℃延伸5 min。分別測目的基因Hepcidin 和內參 β -actionCt值,用 2-(ΔΔCt)表示 Hepcidin基因相對表達量。

1.4統計分析 采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行分析,并進行t檢驗,試驗結果用平均值±標準誤表示。

（4）作業環節的數字化。如對測斜井深、短起下井深、短起下井段等施工環節進行數字化規范，以數字化的作業環節保證井身質量、施工質量。

2　結果與分析

2.1LPS刺激對新生仔豬肝臟、脾臟和血清中鐵含量的影響 由表1可知,與對照組相比,LPS刺激組仔豬肝臟鐵含量顯著降低(P＜0.05),血清中鐵含量極顯著降低(P＜0.01),脾臟鐵含量也降低,但差異不顯著(P＞0.05)。

表1　LPS刺激對新生仔豬肝臟、脾臟和血清中鐵含量的影響

表2　LPS刺激刺激對新生仔豬血清生化指標的影響

2.3LPS刺激對新生仔豬肝臟中Hepcidin mRNA表達量的影響 由表3可知,LPS刺激顯著提高了仔豬肝臟中Hepcidin mRNA表達量(P＜0.05),比對照組提高了43.32%。

表3　LPS刺激對新生仔豬肝臟中Hepcidin mRNA表達量的影響

3　討論

3.1LPS刺激對新生仔豬血清生化指標的影響 LPS是一種革蘭陰性菌膜結構物質,導致腸源性內毒素血癥和細菌移位,大量細菌和毒素機體體內,引起動物應激反應[5]。谷丙轉氨酶在動物體內分布廣泛,且在血液中含量較低,主要反映肝臟的結構和功能。本試驗LPS刺激對血清中谷草轉氨酶無顯著影響,表明炎癥刺激并未破壞仔豬肝臟正常功能。血清TP分為ALB和GLB,是反映動物機體營養水平、蛋白質的吸收和代謝狀況,以及機體免疫水平的重要指標,通常也是動物發生應激反應的標志[6]。本試驗中LPS刺激降低了仔豬血清TP和GLB含量,與劉玉蘭等(2008)[7]的結果一致。表明仔豬受到了較強的應激,仔豬的免疫功能降低。

本試驗結果還表明,LPS多次刺激可顯著降低血清總膽紅素含量。血清中的膽紅素由衰老的紅細胞被破壞后產生出來的血紅蛋白衍化而成,總膽紅素偏低的有可能是因為貧血。本試驗結果也表明,炎癥刺激可顯著降低肝臟鐵和血清鐵含量,因而可以理解成LPS多次刺激仔豬炎癥發生,進而導致貧血,因而降低了總膽紅素含量,但這方面還有待于進一步的研究。血糖主要是指血液中的葡萄糖,來源為腸道吸收、肝糖原分解或肝內糖異生生成的葡萄糖釋放入血液中,本試驗表明,LPS刺激顯著降低了仔豬血糖含量,三羧酸循環是動物體內糖有氧氧化、供能的一個重要途徑。血糖含量降低表明炎癥刺激影響了仔豬正常生理功能,該結果與李爽等(2012)[8]研究結果一致。

3.2炎癥刺激對新生仔豬機體鐵含量及肝臟中Hepcidin基因表達量的影響 關于炎癥刺激對仔豬肝臟Hepcidin基因表達量的影響還未見報道。在大鼠[9]和人[10]上的研究均表明,炎癥或感染性疾病均可使肝臟和腸道Hepcidin基因表達量增加。本試驗結果表明,PLS誘導的炎癥刺激可提高新生仔豬肝臟中Hepcidin基因表達量,從而抑制鐵吸收,降低機體鐵含量。Oliveira-Filho等(2012)[11]在馬上的研究表明,Hepcidin和細胞因子IL-6 mRNA水平在注射脂多糖6 h后升高。Besson-Fournier等(2012)[12]研究表明,炎癥誘導的hepcidin激活主要是通過 Smad1/5/8途徑,隨后 Shanmugam等(2014)[13]利用IL-10基因敲掉的小鼠采用硫酸葡聚糖鈉構成結腸炎模型,進一步證實炎癥調控Hepcidin主要依賴于紅細胞生成素的活性以及腸道菌群。關于調控Hepcidin基因表達的上游信號途徑還有待于進一步研究。另外,在炎癥狀態下,Hepcidin基因表達量增加,促使鐵轉運蛋白(Ferroportin)進入細胞后降解,鐵的轉出被阻斷,鐵就被鎖在巨噬細胞中,導致小腸鐵的吸收以及血清鐵濃度降低。因而炎癥往往也伴隨著貧血[14]。