病毒性出血性敗血癥病毒RNA標準物質的研制

劉志玲,陳 茹,朱道中,吳曉薇,林志雄,田純見,羅 瓊,段燕喻

(廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,廣東 廣州 510623)

病毒性出血性敗血癥(Viral haemorrhagic septicaemia,VHS)是感染鱒魚及其他鮭科魚類、大菱鲆等多種海水魚類引起一種嚴重的致死性傳染性疾病。其病原是彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬的病毒性出血性敗血病毒(VHSV)[1]。該病主要病理變化為組織器官出血、變性、壞死。肝、腎是靶器官,細胞出現空泡化或固縮化[2]。死亡率可達到90% ～100%,對世界水產養殖業的發展造成巨大經濟損失。該病最早發現于歐洲大陸及北美洲[3]。

VHS是世界動物衛生組織(OIE)[4]、亞太水產養殖中心(NACA)規定的必須通報的疫病,同時也是我國規定的進境必檢疫病。國際組織通常對VHS感染國家水產品貿易采取一些限制措施,從而避免帶病魚類流動到其他國家和地區。VHS主要流行于北美洲和歐洲一些國家。迄今為止我國關于VHS暴發的報道極少,但隨著我國水產養殖業的迅速發展和同國際上水產貿易的急劇增加,該病對我國魚類養殖業形成很大的威脅[5]。

目前國內外對VHSV的檢測方法大致可分為兩大類:分子生物學方法和免疫學方法。其中分子生物學方法主要包括 RT-PCR[6]、實時熒光定量PCR[7]、逆轉錄環介導等溫擴增法[8]、焦磷酸測序技術[9]、液相芯片檢測技術等[10];免疫學方法主要包括中和試驗[11]、免疫熒光[12]、酶聯免疫吸附[13-14]等。

分子生物學檢測方法耗時短、特異性強、靈敏度高、已廣泛應用于動物疫病檢測?！禣IE水生動物疾病診斷手冊》也推薦RT-PCR及熒光RT-PCR等方法檢測VHS。但是由于VHS在國內發現較少,且活病毒的流通存在生物安全風險,陽性物質的缺乏制約了實驗室檢測技術的推廣,因此急需構建安全、可靠的陽性核酸物質。

本研究根據《OIE水生動物疾病診斷手冊》推薦的VHS分子生物學檢測方法,利用基因克隆和體外轉錄技術制備了VHSV核酸檢測標準物質,并從均一性、穩定性和定值等幾個方面進行了評價。研制的陽性核酸物質不僅可以為VHS檢測提供陽性質控,同時也可以用于不同試劑、設備以及不同實驗室間的結果驗證和比對,消除檢測間的差異,使其結果具有溯源性。

1　材料與方法

1.1菌毒株及載體 VHS病毒為深圳出入境檢驗檢疫局動植食檢測中心水生實驗室贈送;pGEM-T Easy Vertor System II載體,Promega公司產品;JM109大腸桿菌化學感受態細胞,北京天根生物技術有限公司產品。

1.2主要試劑 RNA提取試劑盒,Promega公司產品;一步法RT-PCR試劑盒、限制性內切酶NdeI,TaKaRa公司產品;DNA膠回收試劑盒,Axygen公司產品;質粒提取試劑盒、RNA純化試劑盒,北京天根生物技術有限公司產品;體外轉錄試劑盒(Ribo-MAXTM Large Scale RNA Production System-T7),Progema公司產品。

1.3標準物質制備用毒株的鑒定 VHSV滅活病毒懸液由深圳出入境檢驗檢疫局國家水生動物疫病檢測重點實驗室贈送。采用OIE水生動物疫病檢測手冊(第2.3.9章)推薦的常規RT-PCR方法鑒定,將擴增產物進行序列測定后與GenBank登錄的序列進行同源性比對,確認毒株為VHSV。將該毒株用作VHSV核酸檢測標準物質的研制。

1.4標準物質的制備

1.4.1重組質粒的構建 根據 GenBank登錄的VHSV毒株的序列以及《OIE水生動物疾病診斷手冊》推薦的VHSV檢測方法,設計用于克隆VHSV NN基因的特異性擴增引物,引物序列見表1,并由ThermoFisher公司合成。對病毒核酸進行RT-PCR擴增后,對擴增產物進行測序分析。將序列正確的基因片段連接于pGEM-Teasy載體,轉化JM109大腸桿菌感受態細胞,挑取白色菌落,經RT-PCR鑒定及序列測定鑒定為陽性后,用天根生化科技(北京)有限公司的高濃度質粒提取試劑盒進行質粒提取。該重組質粒命名為pGEM-N。

表1　引物和預期片段大小

1.4.2目標基因的體外轉錄 選擇重組質粒中位于NNV RNA2基因下游的Nde I限制性內切酶位點對pGEM-N進行單酶切。以線性化的質粒為模板進行體外轉錄,體外轉錄體系如下:T7 Transcription 5 × Buffer,20 μL;dNTPs(25 mmol/L),30 μL;線性化質粒,5-10 μg;Enzyme Mix(T7),10 μL;去離子水,40 μL;總體積為100 μL。 反應條件為37℃溫浴5 h。然后向反應體系中加入10 μL DNA酶,37℃溫浴15 min除去DNA模板。最后用天根生化科技(北京)有限公司生產的RNA純化試劑盒提取純化。將RNA沉淀溶于RNase-Free H20中,得到制備好的N-cRNA片段。

1.4.3N-cRNA純度及含量測定 將上述制備好的N-cRNA作100倍稀釋后用NanoDrop 1000紫外分光儀測定其在波長260 nm與280 nm處的OD值,以分析其純度和濃度。OD260/OD280值在1.8～2.0則RNA的純度較高,比值低于1.8,說明RNA樣品有雜質污染。同時根據單鏈RNA的相對分子質量(MW),按下式計算N-cRNA的拷貝數濃度。拷貝數(copies/μL)=(6.02 ×1023拷貝數/摩爾) ×(濃度g/μL)/(分子量 g/mol)。

1.4.4N-cRNA的稀釋與分裝保存 制備的N-cRNA用系列稀釋成108～104copies/μL,采用熒光RT-PCR方法測定各濃度Ct值,從而獲得標準曲線,建立回歸方程。108copies/μL濃度的樣品混勻后分裝入凍存管,每管1.0 mL,分裝300管,分別保存于室溫(20℃ ～25℃)、冰箱冷藏(2℃ ～8℃)、-20℃,每個溫度下保存20支,剩余的保存于-80℃。

1.5標準樣品的檢測分析

1.5.1均勻性試驗 隨機從-80℃保存的標準物質抽取10支樣品,編號后用《OIE水生動物疫病檢疫手冊》2.3.9章中VHS熒光RT-PCR方法檢測,進行Ct值標定,計算批間不精密度,該檢測為一次操作,一次上機完成。批內不精密度的分析方法是將10支樣品分別抽取10 μL進行混合,混合后分別用熒光定量RT-PCR方法檢測10次。

1.5.2穩定性試驗 從已分裝好的標準物質中隨機抽取樣品按以下保存條件保存,每種條件保存4支。保存條件:(1)室溫(20℃ ～25℃),相對濕度20% ～25%,7 d;(2)冰箱冷藏(2℃ ～8℃),1個月;(3)-20℃,6個月;(4)-80℃(不同條件下穩定性對照組)。取不同條件下的標準物質,分別用OIE推薦的VHS熒光RT-PCR方法檢測,進行Ct值標定,觀察標準物質的穩定性。

1.5.3定值檢測與協作標定 采用熒光RT-PCR檢測方法,并聯合7家其他權威實驗室對制備好的標準物質進行定值。定值方法為將標準物質候選物和已知量值的病毒核酸樣品在相同的實驗條件下分別進行熒光定量RT-PCR,在對候選物定性檢測的基礎上,用已知量值病毒核酸樣品測定的Ct值(循環閾值)對所含模板拷貝數的對數值做線性回歸,繪制標準曲線,得到標準回歸方程,以此方程計算獲得候選物的核酸量值,單位為copies/μL。

1.5.4不確定度分析 通過對實際檢測過程進行分析,綜合考慮人員操作者、設備和試劑帶來的誤差,確定標準品的總不確定度。應用不確定度的A類評定方法進行評定。

2　結果

2.1標準物質制備用毒株的鑒定和篩選 備用毒株經OIE推薦的常規RT-PCR檢測方法鑒定為陽性,且反應結果特異、敏感,符合核酸標準物質制備用毒株的要求。序列分析表明,所擴增的片段與GenBank登錄的其他VHSV毒株同源性均達90%以上,表明克隆所得到的 N基因可以有效代表VHSV的核苷酸序列,可用作核酸檢測標準物質的研制。

2.2N基因片段的擴增 提取VHS病毒RNA,利用所合成的引物擴增N基因序列,RT-PCR擴增產物經電泳后觀察結果(圖1),擴增所得片段與預期大小相符。

2.3N-cRNA純度及含量測定 將體外轉錄合成的cRNA測定其260 nm與280 nm的吸光度值(OD值),N-cRNA,OD260/OD280值 =1.97。 表明轉錄產物的cRNA純度較高。依據所轉錄的單鏈RNA樣品的分子質量和濃度計算獲得cRNA樣品的拷貝數。結果見表2。

圖1　VHSV N基因的PCR擴增

表2　N-cRNA純度及含量測定

2.4N-cRNA標準曲線的建立 取稀釋成8.41×108～8.41×104copies/μL各濃度梯度的標準物質,每個濃度設兩個重復,進行實時熒光定量RT-PCR測定Ct值。根據質?？截悢蹬cCt值的相關性,由SDS軟件 2.1得標準曲線為 Y=-3.773X+49.981。 相關度 R2=0.994(見圖 2)。

圖2　不同稀釋度標準物質的標準曲線

2.5標準物質的均勻性試驗 對隨機抽取的10支標準樣品與混合后的10支標樣進行實時熒光定量RT-PCR反應(圖3),并將檢測結果進行方差分析(F檢驗法),計算管間變異系數和批內均勻性,根據自由度及給定的顯著性水平α,查表得臨界的Fα值,再與公式算得的F值進行比較。結果顯示,F＜Fα,表明分裝的標準物質其組內與組間無明顯結果差異,具有良好的均勻性。結果見表3。

圖3　N-cRNA核酸標準物質均勻性試驗結果

2.6標準物質的穩定性試驗 取不同保存條件下的N-cRNA,并將檢測組與對照組(-80℃)進行Ct測定,數據分別作t檢驗,結果各檢測組t值均小于t檢驗的臨界值(表4),表明各檢測組在穩定性監測期內是穩定的。

2.7標準物質的定值檢測與協作標定 本次定值聯合8家單位參加協作標定,采用測定標準物質濃度,根據片段長度換算拷貝數和協作標定的方式,計算標準物質含量(copies/μL)。8家單位采用統一的試驗方案和結果分析程序,分別取得3次獨立的有效結果,其結果與研制單位的標定結果經統計學分析獲得平均值,結果見表5。

2.8標準物質的不確定度分析 通過對實際檢測過程進行分析,確定標準品的總不確定度,包括:分析測定誤差、RNA提取過程的誤差和樣本不均勻性引起的誤差。定值方法應用A類評定方法進行評定,經計算N-cRNA標準物質的不確定度為0.149×108copies/μL,定值為(6.625 ±0.149) ×108copies/μL,結果見表5。

表3　VHSV核酸標準樣品(N-cRNA)均勻性試驗結果

表4　VHSV核酸標準物質不同保存條件下穩定性試驗結果

3　討論

在動物病毒檢測方法中,分子生物學檢測方法因特異性強、敏感性好是目前最為常用的方法之一。陽性質控用于驗證PCR反應的可靠性,對PCR試驗的質量控制有至關重要的作用。核酸標準物質屬于生物標準物質的一種,可作為核酸擴增技術的陽性質控品,在促進病原核酸擴增檢測方法標準化及提高檢測一致性和準確性方面發揮了重要作用。與重組質粒相比,本研究利用體外轉錄制備的RNA標準物質可在擴增檢測的逆轉錄和PCR擴增兩個方面進行質量控制,更符合RNA病毒檢測標準物質的要求[15]。

表5　VHSV核酸標準物質定值結果

由于VHS目前在我國內報道極少,大部分實驗室由于缺乏病毒陽性質控制約了檢測能力的建立。本研究構建基于VHSV N基因的RNA標準物質無生物安全風險,不易對實驗儀器和環境造成交叉污染而導致假陽性結果,在實際檢測中具有很好的適用性。該標準物質可用于實驗室檢測的質控標準,也可用于不同實驗室間、不同人員、不同試劑的比對標準。該標準物質在我國各檢驗檢疫實驗室及各地方水產技術推廣站的推廣應用,將可推進我國VHSV檢測盡早達到標準化,提升疫病防控把關能力。