犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株在Vero-SLAM細(xì)胞上傳代后的基因突變分析

吳佳琦,李貝影,王介淞,黃 娟,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心,山東 青島 266109)

犬瘟熱(CD)是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,能夠引起宿主的多個系統(tǒng)器官發(fā)生病變[1]。在自然條件下,犬瘟熱病毒能夠使犬科(犬、狐貍、豺、狼)、鼬科(鼬鼠、雪貂、水貂、水獺等)、浣熊科(浣熊、熊貓)、貓科動物(如獅子、虎)等多科動物及海獅和猴發(fā)生感染[1-3]。敏感動物感染犬瘟熱病毒后,典型癥狀是雙相熱,并出現(xiàn)抽搐、口吐白沫等神經(jīng)癥狀和不同程度的胃腸炎、卡他性肺炎,其高發(fā)病率、高死亡率的流行特點(diǎn)對毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)及野生動物保護(hù)都造成了巨大損失。

犬瘟熱病毒屬于副黏病毒科麻疹病毒屬,為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA病毒,基因組全長15 690 bp,呈線性排列,3′端為前導(dǎo)序列,5′端為尾隨序列,兩序列之間為6個非重疊基因區(qū),主要編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白,分別為核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)、基質(zhì)膜蛋白(Matrix protein,M)、融合蛋白(Fusion protein,F)、血凝素蛋白(Hemagglutinin protein,H)和大蛋白(Large virusspecifiedRNAdirectedRNApolymeraseprotein,L)[3]。病毒囊膜表面附著有長約1.3 nm的糖蛋白纖突,纖突由H蛋白和F蛋白組成,二者在感染性病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮了重要作用。

Vero細(xì)胞常用來分離犬瘟熱病毒,但犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代之后常導(dǎo)致毒力降低或丟失,而穩(wěn)定表達(dá)犬瘟熱病毒受體-信號淋巴細(xì)胞激活因子(Signalling lymphocyte activation Molecule,SLAM)的Vero-SLAM細(xì)胞能提高該病毒的分離率[4],因此成為目前分離犬瘟熱病毒的首選細(xì)胞,但犬瘟熱病毒強(qiáng)毒分離株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代之后是否會發(fā)生基因突變尚無報(bào)道。本試驗(yàn)對在Vero-SLAM細(xì)胞傳代培養(yǎng)了12代的犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株進(jìn)行全基因克隆和測序,并與該毒株的原始序列進(jìn)行對比,分析該毒株在Vero-SLAM細(xì)胞上傳代培養(yǎng)有無發(fā)生基因突變,為犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株的分離提供依據(jù),獲得的全基因組基因序列也為反向遺傳學(xué)進(jìn)行病毒拯救奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1毒株及試劑 犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株Hebei株(KC427278)在Vero-SLAM細(xì)胞上傳代培養(yǎng)12代,由本實(shí)驗(yàn)室保存。RNAiso plus裂解液、M-MLV(Reverse TranscriptaseM-MLV)、5 × ReverseTranscriptase M-MLV Buffer、RRI(Recombinant RNase Inhibitor)、dNTP Mixture、10 ×Ex TaqBuffer(Mg2+)、Ex TaqDNA Polymerase、DL-5 000 DNA Marker 和DNA凝膠回收試劑盒TaKaRa MiniMEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、三氯甲烷(氯仿)、異丙醇、75%乙醇、LB液體培養(yǎng)基、pMD18-T Vector載體試劑盒、DH 5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、SOC培養(yǎng)基,均購自TaKaRa公司。

1.2引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)犬瘟熱病毒Hebei株(KC427278)的核苷酸序列,并參考其他CDV基因組全序列,毒株名稱和登錄號分別為CDV SY(KJ466106)、LN(10)1(KP765764)、98-2654(AY466011)、SD(14)7(KP765763)、CDV-RDJL(KJ848781)、HLJ1-06(JX681125)、panda/SX/2014(KP793921)、SD(14)11(KP738610)、CDV-L(KM926612),使用 Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計(jì)10對引物(表1),交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,用于擴(kuò)增CDV全基因,按照合成報(bào)告加滅菌雙蒸水稀釋,放在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　犬瘟熱病毒Hebei株全基因擴(kuò)增引物

1.3病毒RNA的制備及cDNA的合成 應(yīng)用RNAiso plus法對犬瘟熱12代細(xì)胞病毒液進(jìn)行總RNA的提取。吸取250 μL病毒懸液加上750 μL RNA裂解液,顛倒混勻6～8次,冰上靜置5～10 min。12 000 r/min(4℃)離心5 min后吸上清600 μL至新1.5 mL離心管中,加入4℃保存的三氯甲烷溶液200 μL,震蕩混勻后冰上靜置5 min。12 000 r/min(4℃)離心15 min后,吸取上清液300 μL至新的1.5 mL 離心管中,加入 300 μL 等量的異丙醇后,移至-20℃冰箱放置40 min。12 000 r/min(4℃)離心10 min,棄掉上清液,向管中加入4℃保存的75%乙醇1 mL,7 500 r/min(4℃)離心5 min,棄去上清液,室溫干燥,最后加入20 μL去離子水,震蕩混勻-20℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄總體系為20 μL,其中 ddH2O 5.5μL,5 × Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 4 μL,dNTP Mixture 2 μL,上游引物1 μL,下游引物 1 μL,RRI 0.5 μL,M-MLV 1μL,提取的總RNA模板5 μL。42℃水浴60 min,72℃10 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,之后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4基因片段的擴(kuò)增 以cDNA為模板應(yīng)用表1的特異性引物分別擴(kuò)增1～10個片段。PCR反應(yīng)體系為 25 μL:其中 ddH2O 16 μL,10 ×Ex TaqBuffer(Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture 2.0 μL,上游引物 1 μL,下游引物 1 μL,Ex TaqDNA Polymerase 0.5 μL cDNA 模板2 μL。 PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,退火52℃～59℃30 s,延伸1～4 min,35個循環(huán)后,終延伸72℃10 min,最后4℃保存。用膠回收試劑盒從凝膠中純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

2　結(jié)果

2.1CDV Hebei全基因組各片段的克隆以及鑒定應(yīng)用設(shè)計(jì)的10對引物,對Hebei株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,用1%瓊脂凝膠電泳后,獲得與預(yù)期大小相符的片段(圖1)。

圖1　Hebei株基因組不同片段的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2Hebei株全基因組序列的拼接 對10個重疊片段測序和拼接,獲得了 Hebei株基因組全長15 690 bp序列,包括52 bp的3′前導(dǎo)序列,38 bp的5′尾隨序列及6 種結(jié)構(gòu)蛋白 N、P、M、F、H、L,基因大小分別為 1 683 bp、1 655 bp、1 442 bp、2 205 bp、1 947 bp、6 573 bp。

2.3全基因核苷酸序列以及氨基酸分析 將傳代12代的HeBei分離株的全基因序列與GenBank上Hebei株全基因進(jìn)行序列比較分析,結(jié)果表明,病毒傳代后較原始序列有24處堿基突變,14處氨基酸突變(表2)。

3　討論

CDV屬于RNA病毒,在自然條件下及細(xì)胞培養(yǎng)時容易發(fā)生變異,因此在病毒傳代過程中應(yīng)密切監(jiān)測其變異情況。本研究對Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞連續(xù)傳代,通過RT-PCR獲得了覆蓋其全長基因組的10個末端重疊的片段,拼接得到Hebei株全長cDNA序列,并與GenBank上的Hebei毒株原始序列比對。結(jié)果表明,傳代后的序列較原始序列有24處堿基突變,其中3處為非編號碼區(qū)的突變,其余21處在編碼區(qū);堿基突變率分別為N 0.00%、P 0.12%、M 0.06%、F 0.36%、H 0.21%、L 0.12%;堿基的突變導(dǎo)致14處氨基酸的突變,其中,N蛋白氨基酸無突變,P、M、F、H、L蛋白氨基酸突變率分別為 0.39%、0.30%、0.60%、0.50%、0.18%,表明犬瘟熱病毒Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代,突變主要發(fā)生在F上。

在自然環(huán)境中,犬瘟熱病毒H蛋白突變率在所有結(jié)構(gòu)蛋白中最高,因此H蛋白基因序列常用來構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育樹[5]。本研究表明,犬瘟熱野毒株Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代后突變主要發(fā)生在F蛋白上。F蛋白位于犬瘟熱病毒囊膜上,呈纖突狀,是感染性犬瘟熱病毒粒子感染宿主細(xì)胞所必需的成分,病毒通過H蛋白識別、吸附于細(xì)胞表面的CD150/SLAM受體,接著與F蛋白協(xié)同時病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合,完成病毒感染第一步。F蛋白基因序列的變異可能是病毒適應(yīng)細(xì)胞的結(jié)果,強(qiáng)毒株在細(xì)胞上連續(xù)傳代后獲得致細(xì)胞病變效應(yīng)。F蛋白編碼區(qū)由3個部分組成:Fsp區(qū)域(aa 1～135),兩個亞單位 F2(aa 136～224)和F1(aa 225～662),這是通過翻譯后蛋白水解產(chǎn)生的。自然環(huán)境中,犬瘟熱病毒野毒株F蛋白突變主要發(fā)生在Fsp區(qū)域[6],本研究表明犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株Hebei株在Vero-SLAM細(xì)胞上連續(xù)傳代后突變主要發(fā)生在F蛋白的F1亞單位,說明犬瘟熱病毒的基因突變機(jī)制在自然環(huán)境下和細(xì)胞傳代培養(yǎng)后是不同的。

表2　Hebei株的核苷酸和氨基酸突變位點(diǎn)

病毒基因組序列蘊(yùn)含大量的信息,在分子流行病學(xué)中起著重要作用,病毒的全基因組序列為構(gòu)建反向遺傳系統(tǒng)、病毒載體的構(gòu)建以及利用反向遺傳學(xué)改造病毒成為疫苗株提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):