嗜酸乳桿菌在預防雛雞潰瘍性結腸炎發生中的作用及其機制

劉曉靜,鄭世民,孫正陽,高雪麗,呂曉萍,劉超男

(東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種以結腸和直腸病變為主的非特異性炎癥性疾病。以持續或反復發作的腹瀉、黏液膿血便為主要臨床癥狀。近年來UC在我國的發病率逐漸升高,但其病因和發病機制仍不明確,關于UC發病機制的研究主要集中在遺傳與易感性、免疫異常、腸道菌群的改變等方面[1]。國內外一直以化學藥物、激素以及免疫抑制劑等藥物對UC患者進行治療,但是此類藥物只能通過抑制炎癥和免疫反應暫時控制和緩解疾病癥狀,而不能起到根治的作用,停藥后容易復發,且長期服藥會影響機體的免疫功能,對機體造成損傷。嗜酸乳桿菌是腸道內的優勢菌群,粘附于腸上皮細胞,形成生物學屏障,增強機體免疫力[2]。近年來國內外學者經過動物實驗以及臨床實驗證實嗜酸乳桿菌在UC治療中能夠起到重要作用,但其機制尚不明確。UC是一種炎癥性腸病,而Toll樣受體(Toll-like receptor,TLRs)能通過多種途徑調節炎癥反應,因此 UC患者體內 TLRs表達的研究逐漸受到重視,已有研究表明,UC患者TLR2高表達,且隨病情加重,表達量升高[3]。也有學者研究證實,益生菌可以降低 UC大鼠結腸組織中TLR2的表達,并提出益生菌在緩解大鼠UC癥狀中TLR可能發揮重要作用[4]。此外,炎性細胞因子在炎癥性疾病中具有重要作用,可以相互作用影響炎癥進程。因此,本實驗應用嗜酸乳桿菌預防雛雞UC的發生,檢測不同時期各組雛雞血清中IL-8和IL-10含量以及結腸組織 TLR2和 MyD88 mRNA表達量,探討嗜酸乳桿菌在預防雛雞UC中的作用及其機制,為嗜酸乳桿菌等微生態制劑在臨床上治療和預防UC等腸道疾病的應用提供重要的實驗依據。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 75只1日齡SPF雛雞,購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所。

1.1.2主要試劑和儀器 乳酸桿菌 LA(丹麥科漢森有限公司);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(德國Sigma公司);TLR2抗體(北京博奧星生物技術有限責任公司);免疫組化檢測試劑盒,DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);IL-8 ELISA試劑盒,IL-10 ELISA試劑盒(北京誠林生物技術有限公司);切片機(美國Thermo Fisher Scientific有限公司);LightCycler 2.0熒光定量 PCR儀(美國羅氏公司)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物分組與處理 將75只1日齡 SPF雛雞隨機分為嗜酸乳桿菌預處理組(LA+UC組)、模型組(UC組)和對照組(C組)3組,每組25只雛雞。3組雛雞從1日齡開始經口灌服微膠囊,連續3 d,1次/d。LA+UC組雛雞灌服嗜酸乳桿菌微膠囊,其余兩組雛雞灌服空微膠囊。15日齡對3組雛雞進行灌腸,劑量為100 mg/kg體重,LA+UC組和UC組雛雞灌腸液為TNBS乙醇混合液,C組雛雞灌腸液為生理鹽水。 灌腸后 1、3、5、7、9、11 d,每組分別取3只雛雞,心臟采血并分離血清,取結腸組織,部分-80℃凍存,部分固定于10% 中性福爾馬林溶液中。

1.2.2檢測指標和方法

(1)組織病理學檢查:取固定24 h結腸組織修塊,水洗24 h、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,厚度為4 μm,常規 H.E.染色,封片,光學顯微鏡下觀察,病理成像系統分析。

(2)TLR2和 MyD88 mRNA表達量檢測:提取-80℃低溫冰箱凍存的結腸組織中總RNA,采用熒光定量PCR方法檢測結腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量。根據比較閾值法計算出目的基因的相對含量。

(3)血清中 IL-8和 IL-10含量檢測:采用ELISA方法檢測血清中IL-8和IL-10含量。根據IL-8和IL-10 ELISA檢測試劑盒說明書進行操作,用酶標儀測定450 nm處吸光度值,制作標準曲線,回歸計算血清中 IL-8、IL-10含量。

1.2.3統計分析 采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析,比較各組間差異。所有數據以“平均數±標準差”表示,計量資料比較應用t檢驗方法,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2　結果

2.1各組雛雞臨床癥狀和病理變化 造模后UC組雛雞出現采食減少,精神委靡,體重明顯減輕,喜臥,排稀薄糞便,甚至排出血樣糞便,肛門處粘有糞便,3只雛雞死亡;LA+UC組雛雞造模后體重減輕,不喜運動,糞便稀薄并帶有黏液;C組雛雞在整個過程中狀態良好,未出現明顯的臨床癥狀。對雛雞進行剖檢,可見UC組雛雞結腸黏膜明顯充血、水腫,黏膜表面有散在分布的大小不等的潰瘍灶,腸壁粘連,腸道內有大量黏液和血性內容物;LA+UC組雛雞結腸黏膜充血水腫較輕,未見明顯壞死灶;C組雛雞結腸黏膜完整,未見異常。

2.2各組雛雞結腸組織病理學變化 H.E.染色結果顯示,UC組雛雞結腸黏膜大面積壞死脫落,黏膜及黏膜下層有大量炎性細胞浸潤和細胞壞死,隱窩和腺體結構消失;LA+UC組雛雞結腸黏膜結構破壞,黏膜及黏膜下層炎性細胞浸潤;C組雛雞結腸黏膜結構完整,無病變(見中插彩版圖1)。

2.3各組雛雞結腸組織 TLR2、MyD88 mRNA表達變化 通過RT-PCR方法,在UC組、LA+UC組和C組雛雞的結腸組織中均檢測到TLR2和MyD88 mRNA表達。結果顯示,UC組雛雞結腸組織中TLR2 mRNA表達量在TNBS乙醇混合液灌腸后1～7 d顯著或極顯著(P＜0.05或P＜0.01)高于LA+UC組和C組雛雞;而在TNBS乙醇混合液灌腸后1～9 d,UC組雛雞結腸組織中MyD88 mRNA表達量顯著或極顯著高于LA+UC組和C組雛雞(圖2)。

圖2　各組雛雞結腸組織TLR2和MyD88表達變化

2.4各組雛雞血清中IL-8和IL-10含量檢測運用ELISA方法對各組雛雞不同時期血清中IL-8和IL-10含量進行檢測,結果顯示,UC組雛雞TNBS乙醇混合液灌腸后1～11 d,其血清中IL-8含量顯著或極顯著高于LA+UC組和C組雛雞;TNBS乙醇混合液灌腸后1～9 d,LA+UC組雛雞血清中IL-10含量極顯著或顯著高于 UC組雛雞,極顯著高于C組雛雞;C組雛雞在造模后1～7 d,血清中 IL-10含量極顯著低于UC組雛雞(表1)。

表1　各組雛雞血清IL-10和IL-8含量變化

3　討論

UC是一種慢性、反復發作的、主要局限于大腸黏膜及黏膜下層的炎癥性腸病。目前,該病發病機制尚不明確。免疫學因素一直被認為是該病發生的主要因素,并成為該病研究熱點。腸道黏膜免疫系統是由一個復雜的網絡維持平衡的,而UC患者這種平衡被打破,腸道黏膜免疫功能紊亂,而腸道黏膜免疫功能紊亂被認為是炎癥性腸病炎癥發生的主要機制[5]。因此,腸道黏膜免疫在 UC發生發展過程中起著重要作用。嗜酸乳桿菌是腸道內的優勢菌群,能夠促進腸道內菌群平衡,調節腸黏膜免疫功能,與腸道黏膜上皮細胞結合,形成生物屏障,減少有害因素對腸道的破壞。國內外已大量報道,益生菌與傳統藥物聯合應用可以增加UC的治療效果[6],但其在預防雛雞UC中的作用及其機制少有報道。本實驗對3組雛雞臨床癥狀以及結腸組織病理學變化進行觀察,UC組雛雞出現體重減輕、腹瀉、喜臥等臨床癥狀,結腸出現充血、水腫、炎性細胞浸潤和腸黏膜結構不完整等病理變化,而LA+UC組雛雞臨床癥狀和病理損傷程度均低于UC組雛雞,證實嗜酸乳桿菌在預防雛雞UC中具有重要作用。

促炎性細胞因子和抑炎性細胞因子之間的平衡失調所導致的免疫異常被視為UC發病的最重要機制之一[7]。UC患者腸道黏膜促炎因子表達升高,抑炎因子分泌相對不足,使腸黏膜產生過強的炎癥反應,引起腸道損傷[8]。機體與 UC密切相關的促炎因子主要有 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等,抑炎因子主要有IL-4、IL-10等,它們可同時或相繼、直接或間接作用靶細胞,形成細胞因子網絡,在 UC的組織破壞及炎性反應中起著重要作用[9]。IL-8對嗜中性粒細胞、T淋巴細胞和嗜堿性粒細胞的趨化和激活作用,可誘導它們浸潤到炎癥局部,釋放炎性介質,引起炎癥反應,從而導致腸上皮細胞變性、壞死、脫落并廣泛損傷,使腸道吸收面積減少,水分不易吸收,造成水樣糞便[10]。IL-10主要通過抑制T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、自然殺傷細胞、B細胞和肥大細胞等產生前炎性因子和趨化因子,從而起到抗炎作用[11]。研究表明,當機體發生UC時,IL-8表達量顯著升高,重型UC患者血清中IL-8表達量顯著高于輕中度患者,而血清中IL-10表達量會降低,且病程越重表達量越低[12]。在本實驗中,UC組雛雞血清中 IL-8含量顯著高于C組雛雞,說明UC組雛雞IL-8高表達,促進炎癥反應,造成雛雞腸道損傷,促進雛雞UC的發生和發展。LA+UC組雛雞血清中IL-8含量不同程度低于UC組雛雞,且病變程度相對較輕,說明嗜酸乳桿菌可能通過減少IL-8的合成從而降低炎癥反應,預防雛雞UC的發生和發展。血清中IL-10的含量檢測結果顯示,UC組雛雞血清中IL-10含量高于C組雛雞,表明機體在UC發生時做出相應應答,但這種應答不足以抵抗促炎因子促進炎癥反應的作用,造成機體損傷,而 LA+UC組雛雞血清中IL-10的含量不同程度高于UC組和C組雛雞,且LA+UC組雛雞病變程度低于UC組雛雞,證實嗜酸乳桿菌能夠促進抑炎因子IL-10的合成進而減輕炎癥反應,降低UC對腸道的損傷。

TLRs是重要的介導腸道黏膜先天防御反應的介質,可以選擇性結合配體,通過信號傳導介導腸道黏膜免疫反應,在 UC的發生中具有重要作用[13]。近年來對于 TLRs與 UC發生的關系的研究有很多報道,劉翔等實驗證實TLR2在UC患者或者患病模型中高表達[14],但是在雛雞UC的發生中是否也是如此還未見報道。在本實驗中,RTPCR方法檢測到UC組雛雞TLR2 mRNA表達量均高于C組雛雞和LA+UC組雛雞,說明在雛雞UC中,TLR2表達量升高,并且嗜酸乳桿菌可以降低TLR2的表達。髓樣細胞分化因子88(MyD88)是TLR信號傳導通路的下游信號因子,在UC大鼠中MyD88表達高于正常組,且含量的高低與炎癥的程度呈正相關[15]。在本實驗中,UC組雛雞 MyD88 mRNA表達量高于LA+UC組和C組,表明在雛雞發生UC時MyD88表達量會有所升高,通過嗜酸乳桿菌預處理可以明顯減輕其表達。同時,在UC組和LA+UC組雛雞中TLR2和MyD88呈相同的變化趨勢,說明在雛雞UC的發生過程中TLRs/MyD88信號傳導通路可能被激活,TLRs/MyD88信號傳導通路被激活后,可通過調節下游核轉錄因子介導的細胞因子的釋放,從而介導免疫炎癥反應,而嗜酸乳桿菌可以有效降低TLRs/MyD88 mRNA表達,抑制這一信號傳導通路,進而抑制炎癥反應,緩解UC造成的損傷。在本實驗中,血清中IL-8含量變化的趨勢與結腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量的變化趨勢相一致,而血清中IL-10的含量則與結腸組織中TLR2和MyD88 mRNA表達量呈負相關,因此推測嗜酸乳桿菌可能通過抑制 TLR2和MyD88 mRNA表達,抑制TLR2/MyD88信號傳導通路,從而抑制促炎因子IL-8的合成,促進抑炎因子IL-10的合成,起到預防雛雞UC發生和降低損傷的作用。

綜上所述,本實驗證實嗜酸乳桿菌可以預防雛雞UC的發生以及緩解UC對雛雞造成的損傷。此外,通過對不同組雛雞促炎因子IL-8和抑炎因子IL-10含量及相關信號傳導通路的檢測,探索了嗜酸乳桿菌在預防和緩解雛雞UC的發生和發展的作用機制,為嗜酸乳桿菌等微生態制劑在治療腸道疾病的應用提供了理論依據。