食管鱗狀細胞癌中ARTN、GFRα3的表達及臨床意義

陳雅琪，蹇順海， 黃一凡，文 彬

(川北醫學院， 四川 南充 637000)

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，據我國最新流行病學調查報告，其發病率、死亡率均居癌癥的第3位，且呈上升趨勢[1]。食管癌早期癥狀不明顯，5年生存率僅為15%～25%[2]。目前，尚無能協助食管癌早期診斷及評估隨訪患者預后的有效的生物標志物。此外,傳統的臨床病理參數包括腫瘤組織學分級、臨床分期和淋巴結轉移等，不能全面有效地評估患者預后，因此尋找新的生物學指標尤為重要。

ARTN是膠質細胞源神經營養因子家族成員之一，與其受體GFRα1、 GFRα3結合，再激活下游的絡氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase，RET)向細胞內傳遞信號，但ARTN與GFRα3受體的作用更強，能在多種惡性腫瘤中表達，具有促進腫瘤的生長、轉移及新生血管的形成等作用[3]。目前尚無聯合檢測ARTN與GFRα3在食管癌中的表達及與食管癌的臨床病理參數關系的方法，因此本實驗檢測膠質細胞源神經營養因子ARTN及受體GFRα3在食管鱗癌中的表達及其生物學作用，探討其與食管鱗狀細胞癌的發展及預后關系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集川北醫學院附屬醫院2009年1月1日—2010年12月30日存檔確診的食管鱗狀細胞癌石蠟標本114例，標本均重新閱片，患者年齡為39～82歲，平均(57.2±4.23)歲。另選取高級別上皮內瘤變標本17例，年齡為42～75歲，平均(59.6±6.37)歲。選取正常食管組織25例(以正常食管切緣代替)作為對照組。所有標本術前均未經放、化療，術前簽署相關知情同意書，符合醫學倫理學規定。

1.2 方法

標本均按正常程序取材、固定、制片。ARTN兔抗人單克隆抗體(1∶50)購自Abcam公司。GFRα3兔抗人多克隆抗體購自Atlas公司(HPA020731， 1∶600)。即用型檢測試劑、即用型過氧化物酶及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司，兩者以胰腺癌標本做陽性對照，組織本身做陰性內對照。采用免疫組化SP兩步法檢測ARTN、GFRα3蛋白的表達。

1.3 結果判定

ARTN、GFRα3陽性信號定位于癌細胞膜或細胞質，以陽性染色范圍及著色強度共同判定。陽性染色范圍以陽性細胞所占百分比劃分：無細胞著色判為0分；著色范圍小于25%為1分；著色范圍25%～50%為2分；著色范圍50%～75%為3分；著色范圍大于75%為4分。著色強度無色為0分；著色淺黃色為1分；著色棕黃色為2分；著色棕褐色為3分。最后由副高以上級別病理醫師判定，求兩者分數之和。小于等于2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法

數據分析組間比較采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman等級相關分析，以P<0.05判定為差異具有統計學意義。所有統計數據均用SPSS17.0軟件分析完成。

2 結果

2.1 ARTN、GFRα3在食管組織中的表達

ARTN和GFRα3表達于細胞質或細胞膜，可見強陽性、中等陽性、弱陽性及陰性表達，結果以陽性及陰性例數計。ARTN在食管正常組織、高級別上皮內瘤變組織、食管鱗狀細胞癌組織中的陽性率分別為0(0/25)、23.5% (4/17)、80.7% (92/114)，陽性表達率逐漸升高，差異具有統計學意義(P<0. 05)。同樣，GFRα3在3種組織中的陽性率分別為0(0/25)、29.4%(5/17)、76.3%(87/114)，GFRα3的陽性表達率逐漸升高，差異具有統計學意義(P<0. 05)。具體情況見圖1、2和表1。

圖1 ARTN 在食管組織中的表達(SP兩步法)

圖2 GFRα3在食管鱗狀細胞癌中表達(SP兩步法)

2.2 ARTN、GFRα3表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

ARTN、GFRα3兩者在食管鱗癌中的表達與腫瘤浸潤深度及TNM分期相關(P<0.05)，與年齡、性別、腫瘤部位及分化程度、淋巴結轉移無關(P>0.05)，見表2。

表1 不同食管組織中ARTN, GFRα3的表達

注：N為正常食管切緣組織；H代表高級別上皮內瘤變組織；ESCC為食管鱗狀細胞癌組織。

表2 ARTN、GFRα3蛋白表達與食管鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

續表(表2)

2.3 ARTN、GFRα3在食管鱗癌組織中表達的相關性

Spearman等級相關分析結果顯示， GFRα3表達水平伴隨ARTN表達的增高而增高，二者呈正相關關系(r=0.198，P<0.05)，見表3。

表3 食管鱗狀細胞癌中ARTN蛋白和GFRα3蛋白表達之間的關系

3 討論

膠質細胞源神經營養因子ARTN、GFRα3可在多種惡性腫瘤中表達，促進腫瘤生長、浸潤等，發揮致瘤作用，但在各種惡性腫瘤中的作用不盡相同。ARTN在女性生殖系統中子宮內膜癌及乳腺癌中表達與腫瘤發生、發展、浸潤深度及轉移有關，并能影響癌細胞對藥物的反應[3-5]。ARTN表達與肝細胞肝癌腫塊大小、復發及預后相關[6]。胰腺癌中，ARTN的表達促進淋巴結轉移、周圍神經浸潤，并與神經浸潤的范圍和密度相關[7]。Gao等[8]發現：ARTN及受體GFRα1在喉組織中表達，喉鱗癌中表達高于喉息肉組織并與喉鱗癌TNM分期及預后相關，而與年齡、性別、腫瘤部位、分化程度及淋巴結轉移無關，兩者表達具有相關性，共同作用促進腫瘤的進展。另外，LI等[9]研究了ARTN與食管癌的關系，指出ARTN在食管鱗癌組織及培養的癌細胞中表達，在癌組織中的表達高于正常組織，但未研究其與食管鱗癌的臨床病理之間的關系。

本研究采用免疫組化法檢測正常食管組織、高級別上皮內瘤變組織，食管鱗癌組織中ARTN、GFRα3蛋白的表達，結果顯示：ARTN在正常食管組織、高級別上皮內瘤變組織、食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為0、23.5%、80.7%；GFRα3的陽性表達率分別為0、29.4%、76.3%，表達水平逐漸升高，差異具有統計學意義(P<0.05)。結果證實ARTN可能有促進食管鱗癌生長的作用。

患者自身不可抗因素(如年齡)及腫瘤的臨床病理特點是影響患者預后的重要因素，本次實驗研究結果表明：ARTN、GFRα3表達與食管鱗癌浸潤深度、腫瘤分期密切相關，即浸潤越深，腫瘤分期越高，ARTN、GFRα3蛋白表達越高，表明ARTN、GFRα3可能對促進腫瘤的浸潤有重要作用，即一方面通過降解細胞外基質，破壞基膜的完整性，引導癌細胞遷移，從而促進腫瘤生長、浸潤[10]，另一方面ARTN可與多種蛋白酶及生長因子反應，促進腫瘤的血管生成，從而增強腫瘤侵襲能力[11]。ARTN、GFRα3與患者年齡、性別、分化程度及淋巴結轉移無關。

ARTN屬膠質細胞源神經營養因子(glial derived nuerotrofic factor family,GDNF)家族成員之一，其他家族成員包含GDNF、PSPN及NRTN，與相應的配體結合(GFRα1-4)再與RET結合形成復合體并通過多條路徑才能在胞內傳遞信號，發揮生物學作用，其中ARTN能與GFRα1、GFRα3兩種受體結合，但與GFRα3結合能力更強[12]。本次實驗研究結果表明：ARTN、GFRα3在食管鱗癌中表達具有相關性，兩者呈正相關(P<0.05)， GFRα3表達隨ARTN表達升高而升高，兩者共同作用激活下游信號通路，發揮致瘤作用。

綜上所述，ARTN、GFRα3與食管鱗癌發生、發展關系密切，兩者可能促進食管鱗癌的惡性程度及進展。 聯合檢測ARTN和GFRα3的表達對預測食管鱗癌的發生、浸潤及判斷臨床分期有一定參考價值。

[1] 林斌偉,劉芳，譚榜憲.食管癌容積弧形調強放射治療計劃劑量學研究[J].川北醫學院學報,2016,31(6):943-947.

[2] 吳曉鵬,陳強，劉勤，等.MicroRNA-196a對食管癌預后的評估價值及其生物學行為的調控機制[J].中國現代醫學雜志,2017,27(13):50-57.

[3] HEZAM K,JIANG J,SUN F,et al.Artemin promotes oncogenicity,metastasis and drug resistance in cancer cells[J].Rev Neurosci， 2018,29(1):93-98.

[4] WANG X H,LIU Y N,TIAN K,et al.Expression and clinical significance of ARTN and MMP-9 in endometrial carcinoma[J].J Biol Regul Homeost Agents,2017,31(4):879-887.

[5] WU Z S,PANDEY V,WU W Y,et al.Prognostic significance of the expression of GFRalpha1,GFRalpha3 and syndecan-3,proteins binding ARTEMIN,in mammary carcinoma[J].BMC Cancer,2013,13:34.

[6] DING K,BANERJEE A,TAN S,et al.Artemin,a member of the glial cell line-derived neurotrophic factor family of ligands,is HER2-regulated and mediates acquired trastuzumab resistance by promoting cancer stem cell-like behavior in mammary carcinoma cells[J].J Biol Chem,2014,289(23):16057-16071.

[7] ZHANG M,ZHANG W,WU Z，et al.Artemin is hypoxia responsive and promotes oncogenicity and increased tumor initiating capacity in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(3):3267-82.

[8] GAO C,CHENG X,LI X,et al.Prognostic significance of artemin and GFRalpha1 expression in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Exp Ther Med,2014,8(3):818-822.

[9] LI S,LI Z,GUO F,et al.miR-223 regulates migration and invasion by targeting Artemin in human esophageal carcinoma[J].J Biomed Sci,2011,18:24.

[10] 王競.Artemin和MMP-9在大腸癌中表達的關系[J].中國老年學雜志,2013,33(8):1769-1770.

[11] BANERJEE A,WU Z S,QIAN P X,et al.ARTEMIN promotes de novo angiogenesis in ER negative mammary carcinoma through activation of TWIST1-VEGF-A signalling[J].PLoS One,2012,7(11):e50098.

[12] 高莉.神經營養因子Artemin在胰腺癌侵襲轉移中的作用[D].上海：第二軍醫大學， 2012：1-86.