4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的23S rRNA基因突變分析

林 賀， 薛 苗， 汪懷周， 黃曉春， 秦陽華

（1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院檢驗科，上海 201801；2.第二軍醫大學附屬長海醫院實驗診斷科，上海 200433）

利奈唑胺是一種人工合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，通過與細菌核糖體50S亞基結合抑制轉錄的初始步驟起作用，對革蘭陽性菌，包括耐青霉素的肺炎鏈球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP）、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）和耐萬古霉素的腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）都具有良好的抗菌作用。2000年利奈唑胺在美國首先上市，2007年開始在我國臨床使用，對于治療相關病原菌引起的感染發揮了巨大的作用。隨著利奈唑胺在臨床上的廣泛使用，陸續出現了耐藥菌株的報道，但目前其耐藥率依然很低，臨床上最常分離的耐藥細菌為糞腸球菌，衛生部全國細菌耐藥監測網（Mohnarin）2011—2012年革蘭陽性菌耐藥監測報告顯示，只有0.4%的糞腸球菌對利奈唑胺不敏感[1]。腸球菌對利奈唑胺的耐藥機制主要與其細菌核糖體23s rRNA區域堿基突變和/或攜帶含有氯霉素-氟甲砜霉素耐藥（chloramphenicolflorfenicol resistance，cfr） 基因的質粒有關。本研究分析了近期從臨床分離的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的耐藥基因突變情況。

1 材料和方法

1.1 菌株來源

菌株分離自上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院北院收治的4例患者的引流液和中段尿樣本，其中3株菌對利奈唑胺耐藥，1株菌對利奈唑胺中介，見表1。采用法國生物梅里埃公司生產的Vitek 2 Compact 全自動微生物分析系統及配套的鑒定卡（GP）和藥物敏感性卡（GP-68）進行菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗，采用E-test法確認利奈唑胺最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，質控菌株為糞腸球菌（ATCC 29212），體外藥物敏感性試驗結果根據美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） M100-S26標準判讀。

表1 4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌的基本情況

1.2 耐藥基因擴增

糞腸球菌基因組含有4個23S rRNA拷貝基因，突變的數量和位置與其耐藥程度有關，根據文獻[2-3]設計合成聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物，23S rRNA V區靶基因引物、cfr基因引物、23S rRNA4個拷貝基因引物（表2）。擴增采用PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），PCR體系為：DNA模板1 μL，引物1 μL（前向和逆向引物各0.5 μL），PrimeSTAR預混液25 μL，加去離子水至50 μL。擴增條件：98 ℃10 s，55 ℃ 15 s ，72 ℃ 90 s，共30個循環，最后72 ℃延伸2 min。擴增后取5 μL于1%瓊脂糖凝膠100 V電泳60 min，觀察擴增結果，余下45 μL送生工生物（上海）有限公司測序。

1.3 序列分析

23s rRNA序列采用Invitrogen公司AlignX軟件進行擬合和突變分析，參考序列為Enterococcus faecalisV583 （GB：AE016830）。

2 結果

2.1 23S rRNA 區和cfr基因的擴增

4株糞腸球菌均未擴增出cfr基因，23S rRNA V區擴增片段經膠回收和T載體克隆后隨機挑選6個菌落抽提質粒測序，未檢出最常見的G2576U突變。見圖1。

表2 本研究所用的擴增基因的引物序列

圖1 23S rRNA V區序列比對

2.2 基因組4個拷貝23S rRNA基因的擴增

對糞腸球菌基因組4個23S rRNA拷貝基因分別進行PCR擴增并測序，結果顯示僅1株菌（1512104）存在G2576U突變，4株菌均存在U2826C突變，菌株1512160存在G2389A突變，菌株1512163存在U2363C和A2881G突變。見圖2。

圖2 4株糞腸球菌基因組23S rRNA序列比對

2.3 同期利奈唑胺敏感糞腸球菌4個拷貝23S rRNA基因的擴增

因為23S rRNA基因和野生型標準株V583相比出現的主要突變類型是U2826C，位于23S rRNA V區外圍，本研究進一步擴增同期分離的對利奈唑胺敏感的3株糞腸球菌和標準株（ATCC 29212）。結果顯示，3株臨床分離的利奈唑胺敏感糞腸球菌和標準株（ATCC 29212）的23S rRNA基因第2826位均為胞嘧啶C。其余序列與野生型標準株 V583相比均無突變。見圖3。

圖3 3株利奈唑胺敏感糞腸球菌和標準株（ATCC 29212）的測序結果

3 討論

抗菌藥物耐藥是全球性難題，可造成大量的社會衛生資源的浪費和人民生命財產的損失[4]。目前，細菌耐藥現象日益嚴重，根據2015年全國細菌耐藥監測報告，耐萬古霉素糞腸球菌和屎腸球菌分別為0.4%和2.9%。利奈唑胺被認為是治療VRE感染的理想藥物。隨著利奈唑胺在臨床的大量使用，腸球菌對利奈唑胺耐藥現象也漸有報道[5-7]，較明確的耐藥機制主要涉及靶位突變、cfr的產生等。

本研究首先采用PCR進行檢測，發現4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌均不含有cfr基因，推測其耐藥的主要機制是23S rRNA發生耐藥突變。進一步擴增23S rRNA V區并測序，并沒有檢測出文獻報道的最常見的G2576U突變[7-10]。進一步分別擴增4個拷貝23S rRNA基因（圖4）并測序，結果發現僅1株菌存在1拷貝G2576U，4株菌均存在U2826C突變，另外還分別存在G2389A、U2363C和A2881G突變，我們推測可能是U2826C突變導致了菌株對利奈唑胺不敏感。因為4株細菌16拷貝均出現U2826C突變，并且第2 826位堿基位于可變區的外圍，可能是標準序列V583發生了無義突變，我們進一步擴增了同時期臨床分離的對利奈唑胺敏感的糞腸球菌和標準株（ATCC 29212），結果其第2 826位堿基均為胞嘧啶，說明第2 826位可能野生型就是胞嘧啶，且突變不會對利奈唑胺的耐藥性發生變化。很多體外試驗和臨床數據支持抗菌藥物的選擇壓力促進耐藥突變產生的觀點[11-12]，但耐藥突變的產生和使用利奈唑胺的關系并不確定，有未使用利奈唑胺的患者分離到耐藥株的報道[13]，在我們分離的4例患者中有3例曾使用利奈唑胺，另1例未使用利奈唑胺為門診患者。

已發現的糞腸球菌對利奈唑胺的耐藥機制主要涉及23S rRNA突變，導致抗菌藥物和靶位結合障礙，和其他抗菌藥物不存在交叉耐藥，我們分離的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌均對萬古霉素敏感。泰地唑胺是新的噁唑烷酮類抗菌藥物，CLSI M100 S26增加了革蘭陽性球菌泰地唑胺的MIC判斷標準，美國食品與藥品監督管理局也批準泰地唑胺用于治療金黃色葡萄球菌（甲氧西林耐藥菌株和甲氧西林敏感菌株）、各種鏈球菌及腸球菌等革蘭陽性細菌引起的成人急性細菌性皮膚和皮膚組織感染。有報道顯示，盡管與利奈唑胺作用機制相同，但利奈唑胺耐藥并不表示泰地唑胺也耐藥，而利奈唑胺敏感則提示泰地唑胺敏感[14]。因為缺乏泰地唑胺體外藥物敏感性試驗的檢測藥物，所以尚不清楚這4株菌是否對泰地唑胺不敏感。

體外試驗顯示，在長時間利奈唑胺的選擇壓力下，腸球菌23S rRNA基因會發生突變，且突變的拷貝數量會增加，細菌通過同源重組的方式，野生株的基因逐步被突變株的基因所取代，推斷出現突變的拷貝數與耐藥水平相關[11，15]。此次檢測，雖然這3株菌分離自不同病區的患者，也沒有直接證據表明是同源菌，但結合醫院感染特點和藥物敏感性譜分析不排除醫院感染同源菌的可能，另1株分離自門診患者。尚不清楚4個拷貝基因均發生突變的原因，有待進一步研究。

總之，我們分析了臨床分離到的4株利奈唑胺不敏感糞腸球菌23S RNA基因的突變情況，結合同期分離的敏感株和質控菌株，發現耐藥的主要原因是23S rRNA散發突變，提示我們應進一步加強抗菌藥物合理使用管理和醫院感染預防控制工作，防止多重耐藥菌的出現和在醫院蔓延。

[1]李耘，呂媛，薛峰，等. 衛生部全國細菌耐藥監測網（Mohnarin）2011-2012年革蘭陽性菌耐藥監測報告[J]. 中國臨床藥理學雜志，2014，30（3）：251-259.

[2]BOURGEOIS-NICOLAOS N，MASSIAS L，COUSON B，et al. Dose dependence of emergence of resistance to linezolid in Enterococcus faecalis in vivo[J]. J Infect Dis，2007，195（10）：1480-1488.

[3]潘偉光，李一凡，鄧啟文，等. 1株利奈唑胺耐藥糞腸球菌的基因突變檢測[J]. 中國感染與化療雜志，2013，13（2）：115-118.

[4]ROCA I，AKOVA M，BAQUERO F，et al. The global threat of antimicrobial resistance：science for intervention[J]. New Microbes New Infect，2015，6：22-29.

[5]PFALLER M A，MENDES R E，STREIT J M，et al. Five-year summary of in vitro activity and resistance mechanisms of linezolid against clinically important gram-positive cocci in the united states from the LEADER surveillance program （2011 to 2015）[J]. Antimicrob Agents Chemother，2017，61（7）：pii：e00609-pii：e00617.

[6]YU Z J，CHEN Z，CHENG H，et al. Recurrent linezolid-resistant Enterococcus faecalis infection in a patient with pneumonia[J]. Int J Infect Dis，2015，30：49-51.

[7]LI B，MA C L，YU X，et al. Investigation of mechanisms and molecular epidemiology of linezolid nonsusceptible Enterococcus faecalis isolated from a teaching hospital in China[J]. J Microbiol Immunol Infect，2016，49（4）：595-599.

[8]YU Z，CHEN Z，CHENG H，et al. Complete genome sequencing and comparative analysis of the linezolidresistant Enterococcus faecalis strain DENG1[J]. Arch Microbiol，2014，196（7）：513-516.

[9]WANG L，HE Y，XIA Y，et al. Investigation of mechanism and molecular epidemiology of linezolidresistant Enterococcus faecalis in China[J]. Infect Genet Evol，2014，26：14-19.

[10]TIAN Y，LI T，ZHU Y，et al. Mechanisms of linezolid resistance in staphylococci and enterococci isolated from two teaching hospitals in Shanghai，China[J]. BMC Microbiol，2014，14：292.

[11] B OUMGHAR-BOURTCHA?L，DHALLUIN A，MALBRUNY B，et al. Influence of recombination on development of mutational resistance to linezolid in Enterococcus faecalis JH2-2[J]. Antimicrob Agents Chemother，2009，53（9）：4007-4009.

[12] A LLEN G P，BIERMAN B C.In vitro analysis of resistance selection by linezolid in vancomycinsusceptible and -resistant Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium[J]. Int J Antimicrob Agents，2009，34（1）：21-24.

[13]李娟，呂曉菊. 利奈唑胺及其耐藥機制研究進展[J].西部醫學，2009，21（4）：667-668.

[14]SILVA-DEL TORO S L，GREENWOODQUAINTANCE K E，PATEL R. In vitro activity of tedizolid against linezolid-resistant staphylococci and enterococci[J]. Diagn Microbiol Infect Dis，2016，85（1）：102-104.

[15]MARSHALL S H，DONSKEY C J，HUTTONTHOMAS R，et al. Gene dosage and linezolid resistance in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis[J]. Antimicrob Agents Chemother，2002，46（10）：3334-3336.