檢測(cè)尿Ⅳ型膠原的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的建立及尿Ⅳ型膠原在膜性腎病中的臨床應(yīng)用

王 蕾， 陳偉琴， 徐旻一， 陳旭東

（1.上海市第八人民醫(yī)院 上海市第六人民醫(yī)院徐匯分院檢驗(yàn)科，上海 200235；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032）

慢性腎病（chronic kidney disease，CKD）按病理分型大致可分為膜性腎?。╩embranous nephropathy，MN）、系膜增殖性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN）及非膜性腎?。╪on-membranous nephropathy，N-MN）[1-2]。其中MN和MsPGN的主要病理改變?yōu)槟I小球細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積聚和系膜細(xì)胞異常增殖[3]。Ⅳ型膠原（type Ⅳ collagen，ⅣC）是腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）和腎小球ECM的主要成分。其含量、分布和結(jié)構(gòu)變化與MN等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。目前，判斷CKD患者是否發(fā)生膜性改變的方法為腎穿刺活檢，但此方法創(chuàng)傷性較大，因此患者難以接受。而實(shí)驗(yàn)室常規(guī)無創(chuàng)指標(biāo)，如尿微量白蛋白、尿轉(zhuǎn)鐵蛋白及尿IgG等主要用于評(píng)估腎小球?yàn)V膜通透性的改變以及腎臟功能的改變[6]。因此需要尋找一種更好的無創(chuàng)性實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)用于MN的診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。為此，本研究建立了檢測(cè)尿ⅣC的磁微粒電化學(xué)發(fā)光法，并對(duì)該方法進(jìn)行了性能確認(rèn)，同時(shí)探討尿ⅣC在CKD中的臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年12月—2017年6月于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院及上海市第八人民醫(yī)院住院且未接受糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑治療、有明確腎臟穿刺病理診斷的CKD患者274例，其中男150例、女124例，年齡（57.4±15.6）歲。274例CKD患者中MN患者139例、MsPGN患者90例（IgA腎病75例、局灶節(jié)段腎小球硬化15例）、N-MN患者45例。根據(jù)美國(guó)腎臟病協(xié)會(huì)（the National Kidney Foundation，NKF）2002年發(fā)布的慢性腎臟病臨床實(shí)踐指南中描述的CKD分期標(biāo)準(zhǔn)[7]將139例MN患者分為5期，其中CKD1期48例、CKD2期36例、CKD3期28例、CKD4期11例、CKD5期16例。選取上海市第八人民醫(yī)院健康體檢者83名作為正常對(duì)照組，其中男45名、女38名，年齡（55.3±13.9）歲。正常對(duì)照組性別、年齡與CKD組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑

AutoLumo A2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀（鄭州安圖公司）及配套試劑（磁微粒化學(xué)發(fā)光法）。

1.3 方法

收集所有對(duì)象的晨尿樣本。在原有的血清ⅣC檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上，與廠商合作，制備適用于尿ⅣC檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，濃度依次為0、5、10、20、50、100 ng/mL。由于ⅣC無國(guó)際公認(rèn)的參考測(cè)量程序及參考物質(zhì)，故根據(jù)GB/T21415—2008描述的方案，依據(jù)廠商建立的測(cè)量程序，并選用廠商工作校準(zhǔn)品，對(duì)該方法的檢測(cè)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP5-A2[8]、EP9-A2[9]、EP6-A[10]等文件的要求以及儀器和試劑的產(chǎn)品技術(shù)要求進(jìn)行方法學(xué)性能評(píng)價(jià)。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 尿ⅣC標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、5、10、20、50、100 ng/mL。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)光單位（relative light unit，RLU）為縱坐標(biāo)，列出回歸方程。

1.4.2 最低檢測(cè)限 選擇3份低值樣本（1.5、2.7、6.2 ng/mL），每份樣本分別測(cè)定10次，得到10個(gè)檢測(cè)結(jié)果的RLU值，計(jì)算相應(yīng)的尿ⅣC水平，依此得出3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)差s1、s2、s3，用線性回歸法擬合曲線，延長(zhǎng)該線與縱坐標(biāo)相交于s0（空白樣本的標(biāo)準(zhǔn)差）。3s0即為該方法的最低檢測(cè)限。

1.4.3 精密度 將低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）、高值（241.1 ng/mL）樣本批內(nèi)重復(fù)檢測(cè)10次，計(jì)算出批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。將低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）樣本連續(xù)檢測(cè)4 d，每天重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算批間CV。

1.4.4 線性分析 取接近線性范圍上限的樣本（H）及接近線性范圍下限的樣本（L）各1份，按不同的比例制備6個(gè)濃度梯度的樣本，每份樣本重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算均值。將均值與理論值按照最小二乘法進(jìn)行擬合，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)。

1.4.5 回收試驗(yàn) 在已測(cè)得尿ⅣC水平的樣本中分別加入不同量的ⅣC標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)。每份樣本檢測(cè)2次，取均值。比較檢測(cè)值與理論值的差異，計(jì)算回收率。

1.4.6 最佳臨界值 采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)正常對(duì)照組、MN組及MsPGN組的尿ⅣC水平。分析結(jié)果并繪制受試者工作特征 （receiver operating characteristic，ROC）曲線，計(jì)算約登指數(shù)，以約登指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的尿ⅣC水平為最佳臨界值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0及SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布，采用中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。采用ROC曲線評(píng)估尿ⅣC對(duì)MN的診斷效能。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿ⅣC檢測(cè)磁微粒化學(xué)發(fā)光法的建立及方法學(xué)評(píng)估

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將濃度分別為0、5、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測(cè)2次，取均值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X， RLU值為Y，進(jìn)行二次擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線擬合方程為Y=42.802X2+106 26X-10 856（r2= 0.999）。見圖1。

圖1 尿ⅣC檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 最低檢測(cè)限 將尿ⅣC水平分別為1.5、2.7、6.2 ng/mL的標(biāo)本重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算得s1、s2、s3分別為0.542 0、0.630 9、0.757 5 ng/mL。用線性回歸法擬合曲線，方程為Y=0.043 7X+0.492，s0=0.492，計(jì)算得磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)尿ⅣC的最低檢測(cè)限為1.48 ng/mL。

2.1.3 精密度 低值（2.7 ng/mL）、中值（27.3 ng/mL）和高值（241.1 ng/mL）樣本的批內(nèi)CV分別為4.22%、8.16%和3.46%，符合要求（≤15%）。低值（3.1 ng/mL）、中值（41.8 ng/mL）樣本的批間CV分別為18.23%、17.61%，符合要求（≤20%）。

2.1.4 線性分析 制備6個(gè)濃度梯度的樣本，每份樣本測(cè)定2次，計(jì)算均值并與理論值按照最小二乘法擬合，計(jì)算得磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)尿ⅣC的線性相關(guān)系數(shù)為0.995，符合要求（r≥0.990）。見表1。

2.1.5 回收試驗(yàn) 平均回收率為97.0%，符合回收率在90%～110%范圍內(nèi)的要求。見表2。

2.1.6 尿ⅣC對(duì)MN的診斷效能評(píng)價(jià)

ROC曲線分析顯示，尿ⅣC診斷MN的曲線下面積 （area under curve，AUC）為0.875[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI） 0.837～0.913]（p＜0.001），最佳臨界值為4.15 ng/mL，敏感性為79.0%，特異性為86.7%。見圖2。

表1 不同濃度梯度樣本的測(cè)定結(jié)果 （ng/mL）

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果

圖2 尿ⅣC診斷MN的ROC曲線

2.2 尿ⅣC的臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)

2.2.1 不同病理類型的CKD患者尿ⅣC水平比較MN組、MsPGN組、N-MN組尿ⅣC水平均明顯高于正常對(duì)照組（p＜0.01）。MN組、MsPGN組尿ⅣC水平均明顯高于N-MN組（p＜0.01）。見表3。

表3 不同病理類型的CKD患者尿ⅣC水平比較[ng/mL，M（P25～P75）]

2.2.2 不同CDK分期的MN患者的尿ⅣC水平比較

MN患者CKD1期與CKD2、CKD3、CKD4期比較，尿ⅣC水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01），而與CKD5期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 不同CDK分期的MN患者尿ⅣC水平比較[ng/mL，M（P25～P75）]

3 討論

有研究結(jié)果顯示，我國(guó)MN發(fā)病數(shù)約占原發(fā)性腎小球腎炎的23.4%[11]。2016年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，MN在近11年內(nèi)以每年13%的速度增長(zhǎng)，成為發(fā)病率增長(zhǎng)最快的腎小球疾病[11]。MN起病較為隱匿，易被漏診、誤診，且較難治愈，病情復(fù)發(fā)率高，極易出現(xiàn)靜脈血栓、感染和腎衰竭等并發(fā)癥[12]。目前，臨床上除腎活檢外尚無更好地診斷MN的方法或指標(biāo)。雖然腎活檢技術(shù)為腎臟疾病的病理診斷提供了準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)，但其創(chuàng)傷性不容忽視。在MN及MsPGN患者中，往往特征性地表現(xiàn)為系膜細(xì)胞增殖和ECM進(jìn)行性積聚[13-14]。ⅣC是構(gòu)成腎小球ECM的主要成分之一，因此在MN及MsPGN患者基底膜與系膜中會(huì)出現(xiàn)ⅣC分泌明顯增加。雖然MN及MsPGN患者血清ⅣC水平會(huì)升高，但由于血清ⅣC檢測(cè)的干擾因素較多，在患肝臟疾病、心肌纖維化及肺間質(zhì)纖維化等疾病時(shí)血清ⅣC水平也均可升高，故其對(duì)MN、MsPGN診斷的特異性較低。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果表明，包括糖尿病腎病等在內(nèi)的MN和MsPGN患者的尿ⅣC水平明顯高于正常對(duì)照組[14-16]。然而，目前尚缺乏較為理想的檢測(cè)尿ⅣC的方法，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為檢測(cè)方法的進(jìn)口試劑盒價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，對(duì)人員的要求較高，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性也較差，因此絕大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室尚未開展尿ⅣC檢測(cè)。為此，有必要建立更為敏感、特異且操作簡(jiǎn)便、成本較低的檢測(cè)尿ⅣC的方法。本研究建立了檢測(cè)尿ⅣC的磁微粒化學(xué)發(fā)光法。性能確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的最低檢測(cè)限為1.48 ng/mL，有良好的線性與重復(fù)性，低值、中值和高值樣本的批內(nèi)CV分別為4.22%、8.16%和3.46%，低值和中值樣本的批間CV分別為18.23%、17.61%，正確度符合臨床要求（平均回收率為97.0%）。

本研究結(jié)果還顯示，MN組、MsPGN組、N-MN組尿ⅣC水平均明顯高于正常對(duì)照組（p＜0.01），MN組、MsPGN組尿ⅣC水平明顯高于N-MN組（p＜0.01）。由此可見，尿ⅣC對(duì)MN及MsPGN均有較高的診斷及鑒別診斷價(jià)值。將139例MN患者根據(jù)CDK分期分為5組，結(jié)果顯示CKD1～3期尿ⅣC水平逐漸升高（p＜0.01），說明隨著MN、MsPGN患者疾病的進(jìn)展，ECM分泌增加，尿ⅣC水平逐漸升高。因此，尿ⅣC水平與MN、MsPGN的疾病進(jìn)展相關(guān)。而CKD4、CKD5期患者尿ⅣC水平較CKD3期患者逐漸降低，這可能是由于終末期患者腎臟排泄障礙導(dǎo)致成份潴留所致。另外，CKD4、CKD5期患者一般為嚴(yán)重腎功能不全、腎衰竭的患者，因此部分CKD4期及所有CKD5期患者會(huì)進(jìn)行腎臟透析，透析過程中部分蛋白質(zhì)被濾除，這也會(huì)導(dǎo)致尿ⅣC水平下降。

綜上所述，本研究建立了檢測(cè)尿ⅣC的磁微粒電化學(xué)發(fā)光法。該方法敏感、特異、快速、準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，試劑價(jià)格低廉，適宜在臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。臨床應(yīng)用結(jié)果證實(shí)尿ⅣC對(duì)MN及MsPGN患者具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]PONTICELLI C， GLASSOCK R J. Glomerular diseases： membranous nephropathy-a modern view[J]. Clin J Am Soc Nephrol，2014，9（3）：609-616.

[2]CHEN Y，LI P，CUI C，et al．Biopsyproven kidney diseases in the elderly： clinical characteristics，renal histopathological spectrum and prognostic factors[J]. J Int Med Res，2016，44（5）：1092-1102.

[3]MINER J H．The glomerular basement membrane[J].Exp Cell Res，2012，318（9）：973-978．

[4]任惠珠，王珊珊，鄭妙艷，等. 腎小球基底膜中膠原的合成、降解與糖尿病腎病[J]. 國(guó)際內(nèi)分泌代謝雜志，2015，35（4）：252-254.

[5]MAO M，ALAVI M V，LABELLE-DUMAIS C，et al. Type Ⅳ collagens and basement membrane diseases： cell biology and pathogenic mechanisms[J].Curr Top Membr，2015，76：61-116.

[6]RAVIDA A，MUSANTE L，KREIVI M，et al．Glycosylation patterns of kidney proteins differ in rat diabetic nephropathy[J]. Kidney Int，2015，87（5）：963-974.

[7]National Kidney Foundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease：evaluation，classification， and stratification[J]. Am J Kidney Dis，2002， 39 （2 Suppl 1）：S1-S266.

[8]Clinical and Laboratory Standards Institute. Evaluation of precision performance of quantitative measurement methods[S]. EP5-A2，CLSI，2004.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute. Method comparison bias estimation using patient samples[S].EP9-A2，CLSI，2010.

[10]Clinical and Laboratory Standards Institute.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures[S]. EP6-A，CLSI，2003.

[11]XU X，WANG G，CHEN N，et al．Longterm exposure to air pollution and increased risk of membranous nephropathy in China[J]. J Am Soc Nephrol，2016，27（12）：3739-3746.

[12]CHEN X，CHEN Y，SHI K，et al．Comparison of prognostic，clinical，and renal histopathological characteristics of overlapping idiopathic membranous nephropathy and IgA nephropathy versus idiopathic membranous nephropathy[J]. Sci Rep，2017，7（1）：11468.

[13]LI Y，WANG J，ZHU X，et al．Urinary protein markers predict the severity of renal histological lesions in children with mesangial proliferative glomerulonephritis[J]. BMC Nephrol，2012，13：29.

[14]王蕾，康懿，符玉瑛，等. 尿Ⅳ型膠原酶免疫測(cè)定法的建立及其在糖尿病腎病中的應(yīng)用[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2004，19（3）：181-184.

[15]MAK K M，MEI R. Basement membrane type Ⅳcollagen and laminin： an overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease[J]. Anat Rec（Hoboken），2017，300（8）：1371-1390.

[16]MAHENDRAN K B，BHASKAR M V，SANTHA K，et al. Plasma and urinary type Ⅳ collagen levels for early detection of nephropathy in type 2 diabetes mellitus patients[J]. Int J Health Sci（Qassim），2016，10（4）：492-498.