流式熒光點(diǎn)陣技術(shù)在乙型肝炎病毒基因分型中的應(yīng)用

朱 俊，朱宇清，朱嶺峰，蔣玲麗，徐 翀

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）感染是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的首要原因，全球大約有2.4億HBV感染者[1]，我國的乙型肝炎患者達(dá)1.2億[2]。由于HBV雙鏈DNA的復(fù)制過程中RNA等中間產(chǎn)物和逆轉(zhuǎn)錄酶的作用，以及DNA聚合酶缺乏校正功能而使HBV基因組具有較大的變異性[3]。迄今為止，根據(jù)HBV全基因組序列分析將HBV分為10種（A～J）基因型和多種亞型，不同基因型之間的核酸序列異質(zhì)性≥8%，不同亞型之間序列差異為4%～7%[2，4-6]。有研究結(jié)果表明，HBV基因型與乙型肝炎臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性、對抗病毒治療應(yīng)答及預(yù)后有關(guān)[7-8]。目前，國內(nèi)外對于HBV基因分型多采用測序方法，但測序方法存在繁瑣耗時(shí)、成本較高的不足。我們研發(fā)了一種基于流式熒光點(diǎn)陣技術(shù)（又稱液態(tài)芯片法）的HBV基因型B型和C型的檢測方法，具有特異性強(qiáng)、操作簡便靈活并易自動化的特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2015年4月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科采用測序法進(jìn)行HBV基因分型的血清樣本67份，其中B型24份、C型43份。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 （1）TC-96/G/H（b）A Life Pro梯度基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）。（2）EPS100核酸電泳儀（上海天能科技有限公司）。（3）FR-200A全自動紫外與可見分析裝置（上海復(fù)日科技有限公司）。（4）Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣（液相芯片）儀（美國Luminex公司）。

1.2.2 試劑 （1）DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）。（2）BestarTaq DNA Polymerase DNA聚合酶（德國DBI Bioscience公司）。（3）引物和探針由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。測序引物 HBV B型擴(kuò)增引物：HBV-BF 5'-GTCCTCTAATTCCAGGAT-3'，其中5'端第5個(gè)T用生物素標(biāo)記，HBV-BR 5'-CGTAGGTTTTGTACAGCAACGT-3'。HBV C型擴(kuò)增引物：HBV-CF 5'-ACAACATCTTGAGTCCCTTCTT-3'，其中5'端第5個(gè)T用生物素標(biāo)記，HBV-CR 5'-CCATGAAGTTAAGGGAGTTGC-3'。探針（5'起第9個(gè)堿基T用氨基修飾）：HBV B型探針ACTCCTGCTCAAGGAACCTCTA；HBV C型探針TCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAA。（4）鏈霉親和素-藻紅蛋白（美國Invitrogen公司）。（5）熒光編號的（表面羧基修飾）聚苯乙烯微球（美國Luminex公司）。

1.3 檢測技術(shù)原理

1.3.1 核酸探針與微球偶聯(lián) 從探針5' 起第9個(gè)堿基T氨基化，聚苯乙烯微球表面用羧基修飾。探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。

1.3.2 多重聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物與探針雜交 PCR引物5'端第5個(gè)T用生物素標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如與微球表面探針互補(bǔ)，則生物素連接至微球表面，加入鏈霉親和素-藻紅蛋白后即可通過鏈霉親和素與生物素的結(jié)合而使藻紅蛋白熒光標(biāo)記至微球。微球表面的藻紅蛋白熒光在激光激發(fā)下發(fā)光。見圖1。

圖1 熒光點(diǎn)陣技術(shù)原理

1.4 方法

1.4.1 多重PCR擴(kuò)增 （1）DNA提取：根據(jù)DNA提取試劑盒的說明書進(jìn)行DNA提取。（2）反應(yīng)體系組成：模板DNA2 μL，上、下游引物2 μL，PCR預(yù)混液（含熱啟動TaqDNA酶、MgCl2和 dNTP Mix）10 μL，雙蒸水6 μL，至總體積20 μL。（3）反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存。

1.4.2 雜交檢測 （1）探針與微球偶聯(lián)：用蒸餾水將2種寡核苷酸探針溶解，調(diào)節(jié)濃度為1 mM/L。分別從2個(gè)熒光編碼的微球儲存懸液中取2.5×106個(gè)微球到2個(gè)離心管中。以蒸餾水將1 mM/L濃度探針進(jìn)一步稀釋10倍，各取2 mL至混勻的相應(yīng)的微球里混合并避光孵育30 min，探針通過修飾的氨基偶聯(lián)至修飾羧基的微球表面。偶聯(lián)后的微球經(jīng)洗滌后用pH值8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液將偶聯(lián)微球重懸浮。將分別偶聯(lián)B型和C型探針的2種微球等比例混合，各種微球的終濃度為1 500個(gè)/μL，2～8 ℃避光保存。（2）PCR產(chǎn)物與探針雜交：用雜交液將偶聯(lián)微球濃度稀釋至150個(gè)/μL作為微球工作液。取33 μL微球工作液，與多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和TE溶液（共17 μL）混合，在95～100 ℃孵育5 min以去除寡核苷酸的二級結(jié)構(gòu)。在雜交溫度48 ℃下孵育反應(yīng)60 min，加入10 μg/μL的鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75 μL后繼續(xù)孵育15 min完成雜交和熒光標(biāo)記。（3）上機(jī)檢測：在Luminex 200液相芯片儀上，保持雜交溫度，對各反應(yīng)孔進(jìn)行檢測分析，測定平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity， MFI）值。

1.4.3 結(jié)果分析 檢測時(shí)以不含有HBV DNA序列的質(zhì)粒作為陰性對照，以MFI值＞150作為陽性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。陽性閾值是以10個(gè)陰性標(biāo)本MFI的平均值加上2s確定。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗(yàn)

將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合B型和C型探針的2種微球在同一反應(yīng)體系中雜交，Luminex 200液態(tài)芯片儀檢測結(jié)果顯示，人DNA、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus， Sau）DNA和人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV）DNA樣本的MFI均＜150，顯示為陰性結(jié)果。18、19和20號樣本與C型探針雜交呈陽性反應(yīng)，與B型探針不發(fā)生反應(yīng)；33和34號樣本與B型探針雜交呈陽性反應(yīng)，與C型探針不發(fā)生反應(yīng)。這2個(gè)組雜交結(jié)果均與測序結(jié)果相符。見表1。

表1 B型和C型2種探針的特異性試驗(yàn)

2.2 液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果比較

經(jīng)測序法基因分型確定為B型的24份樣本中，23份經(jīng)液態(tài)芯片法檢測獲得與測序同樣的結(jié)果，但有1份樣本同時(shí)顯示與B型和C型探針均有陽性雜交信號；經(jīng)測序法確定為C型的43份樣本中，有40份樣本在液態(tài)芯片法的檢測中獲得與測序同樣結(jié)果，但有3份樣本同時(shí)與B型和C型探針有陽性雜交信號。見表2。

表2 液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果的比較

3 討論

HBV屬于嗜肝DNA病毒科家族，呈全球性分布，是導(dǎo)致人類嚴(yán)重慢性肝病（如慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌）的最主要原因[9]。自1965年BLUMBERG等[10]發(fā)現(xiàn)HBV后，HBV的第1種疫苗于5年后問世[11]。從1982年起，由于 ＞10億支HBV疫苗的使用，使全球感染HBV而導(dǎo)致的死亡率顯著下降[12]。但盡管如此，數(shù)億患者已經(jīng)成為HBV慢性感染的事實(shí)使得根除乙型肝炎的任務(wù)異常艱巨。諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Blumberg教授認(rèn)為可以通過3種重要的方式來根除HBV[11]：有效的全球疫苗接種、準(zhǔn)確的診斷分析技術(shù)和對于HBV攜帶者的有效治療。而缺乏對HBV遺傳特性的了解，則難以達(dá)到此目的。

自從1988年OKAMOTO等[13]首次建立了HBV基因型的分型標(biāo)準(zhǔn)并將HBV分為A、B、C和D 4種基因型以后，經(jīng)過NORDER等[14]、STUYVER等[15]、WU等[16]、YU等[17]和TATEMATSU等[18]的補(bǔ)充和發(fā)展，根據(jù)HBV全基因系列不同基因型間核酸序列差異≥8%、亞型之間差異為4%～7%的原則，至今可將HBV分為A～J共10種基因型，并可進(jìn)一步分為諸多亞型（以數(shù)字表示）。HBV基因分型與之前報(bào)道的根據(jù)HBV表面抗原2對互相排斥的亞型決定簇（d/y和w/r）而建立的血清分型部分相關(guān)[6]，2種分型方式并不能建立完全的對應(yīng)關(guān)系，比如血清型adw并不只存在于1種基因型中[19]。目前認(rèn)為以基因型來反映HBV的變異更為準(zhǔn)確。HBV基因型的分布具有顯著的民族和地理區(qū)域差異[2]，并且與乙型肝炎的臨床表現(xiàn)、病程、抗病毒治療應(yīng)答以及預(yù)后有關(guān)[7-8]。因此，準(zhǔn)確的HBV基因分型對于乙型肝炎的預(yù)防、診斷、治療以及預(yù)后判斷均有重要意義。

迄今為止，通過與美國國家生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information， NCBI）網(wǎng)站上的BLAST軟件的比對，對HBV進(jìn)行全基因組序列分析是區(qū)分HBV基因型和亞型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。其他用于HBV基因分型的分子生物學(xué)方法還包括：PCR-限制性片段長度法、型特異性引物PCR、寡核苷酸基因芯片法、限制性片段質(zhì)譜多態(tài)性技術(shù)、質(zhì)譜分析、實(shí)時(shí)熒光PCR、線形探針反向雜交技術(shù)以及反向點(diǎn)雜交等方法。但這些方法的缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確分型、容易受基因組堿基突變而影響引物和DNA或探針和DNA的配對而導(dǎo)致分型結(jié)果難以歸類，檢測成本高、需要特殊儀器等[20]。測序法因其可以直接分析HBV全基因組的序列，所以分型結(jié)果最為可靠。因此，雖然有多種HBV分型方法，基因測序仍然是HBV分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，測序方法檢測成本較高、技術(shù)相對復(fù)雜且需要測序儀器，故不適合臨床廣泛應(yīng)用[20]。

本研究以亞洲主要流行的B型和C型HBV為研究目標(biāo)，研發(fā)了一種利用多重PCR技術(shù)結(jié)合液態(tài)芯片技術(shù)對HBV進(jìn)行基因分型的方法，目前市場上尚無相同產(chǎn)品。引物和探針的設(shè)計(jì)參考了世界衛(wèi)生組織等機(jī)構(gòu)推薦的病毒株序列和引物序列，與NCBI的HBV核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，以確保所設(shè)計(jì)引物和探針序列的特異性、穩(wěn)定性和代表性，并同時(shí)兼顧我國地區(qū)高發(fā)毒株的情況。本研究檢測了經(jīng)測序確認(rèn)的B型和C型HBV患者樣本各20份，結(jié)果顯示自建的液態(tài)芯片法與測序法結(jié)果的一致性高達(dá) 94%， 達(dá)到了預(yù)期的目的。值得指出的是，在24份測序結(jié)果為B型患者中有1份樣本檢測出B型和C型雙陽性探針信號；43份樣本測序法結(jié)果為C型的患者中有3份樣本檢測出B和C型雙陽性探針信號，我們認(rèn)為這4份樣本的患者可能是HBV B型和C型混合感染。KAO等[21]于2002年即報(bào)道了在日本獻(xiàn)血員中發(fā)現(xiàn)有HBV的B型和C型混合型感染的存在。對于HBV混合型感染的鑒定，采用型特異性引物擴(kuò)增的方法優(yōu)于測序方法，因?yàn)槿绻粚CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測序，通常只能檢測到優(yōu)勢毒株的基因型，載量低的毒株序列大多難以測出，除非我們對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行克隆，再選取多個(gè)克隆進(jìn)行測序，這樣才有可能檢測到弱勢基因型的毒株，但采取這樣的技術(shù)需要更長的檢測周期，在臨床常規(guī)檢測中并不可行。本研究設(shè)計(jì)的液態(tài)芯片法初步顯示能夠更敏感和特異地檢測出混合型感染，但還需對這4份樣本作進(jìn)一步驗(yàn)證，以確定本技術(shù)在鑒定HBV混合感染中的優(yōu)勢。

本研究建立的HBV液態(tài)芯片法有廣泛的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)所用的微球如用不同強(qiáng)度的二維熒光編碼，可以做到在同一個(gè)體系中同時(shí)檢測到100多個(gè)不同熒光編碼的微球群體，通過對每個(gè)微球群體標(biāo)記不同的核酸探針，就可以在同一個(gè)體系中同時(shí)檢測100多個(gè)分析物。因此，本方法開發(fā)成功的意義在于不僅能有效地檢測HBV和鑒定其亞型，為其他各種病原體的確定及其亞型鑒定、病原體多種耐藥基因分析等提供多重、簡便、快速檢測的可能，甚至還能為一些復(fù)雜性疾病、遺傳性疾病多基因多位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)多重平行檢測提供可行的方法。

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