CAP認可要求下SYSMEX XN-9000血液分析儀測定網織紅細胞及其參數的性能驗證與干擾因素研究

蔣浩琴，顧劍飛，陳 健，王 吉，王凱俊，呂 元

（復旦大學附屬華山醫院檢驗醫學科，上海 200040）

網織紅細胞（reticulocyte，RET）計數用于評估骨髓中紅系增生活躍度已在臨床上使用多年，在血液學檢驗中常使用新亞甲藍（new methylene blue，NMB）染色的手工目視計數法。近年來，新一代采用流式細胞術原理檢測RET的血液分析儀，能快速、準確地檢測RET，并能提供更多RET特異性熒光參數，特別是未成熟網織紅細胞指數（immature reticulocyte fraction，IRF），已成為骨髓和造血干細胞移植及化療后骨髓再生的早期標志物[1-3]。有研究結果表明，與RNA結合使RET發出熒光的染料可能會對RET檢測造成干擾，如使用某些藥物或存在某些病理狀態可能導致信號終止或自發熒光[1，4]。正式應用于臨床前，我們對SYSMEX XN-9000血液分析儀檢測RET及其熒光參數的精密度、攜帶污染率、可比性、線性范圍、準確度、干擾因素等[5-6]進行了嚴格的方法學驗證。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

SYSMEX XN-9000全自動血液分析儀和配套試劑、配套質控品（日本Sysmex公司），尼康雙目顯微鏡（日本尼康公司），NMB染色劑（珠海BASO公司）。

1.2 定義

美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和國際血液學標準化委員會（the International Council for Standardization in Haematology，ICSH）的H44-A2 指導文件關于RET的定義[6]：介于有核紅細胞和成熟紅細胞中間的紅細胞，當被活體染色劑（如NMB）染色時，含能被染色的核酸（細胞內RNA）或與特定的核酸結合且被熒光劑染色時，顯示細胞內增高的熒光強度。需注意的是，采用顯微鏡檢查RET時，細胞必須含有2個或2個以上深藍色的顆粒（NMB-RET），并且清晰可見，無需顯微鏡對單個細胞特別聚焦調整即能發現其存在，這些顆粒應遠離細胞邊緣，避免與Heinz小體相混。

1.3 標本收集

用真空采血管（美國BD公司）采集乙二胺四乙酸二鉀為抗凝劑的靜脈血標本2 mL，采集對象為無任何基礎疾病的體檢人群，除參考區間驗證外，其他用于方法學驗證的采集對象為復旦大學附屬華山醫院門診和住院患者。除穩定性試驗外，其余檢測均在標本采集4 h內完成。

1.4 儀器校準

方法學評估前，儀器已完成半年1次的校準和校準驗證，校準精密度要求為變異系數（coefficient of variation，CV）＜2%[6]。

1.5 精密度驗證

1.5.1 批內精密度 選擇網織紅細胞計數絕對值（reticulocyte absolute value，RET#）低值（＜10×109/L）、中值[（10～60）×109/L]、高值（＞200×109/L）[6]的靜脈抗凝血各5份，每份連續測定11次，棄第1次結果，各自計算標準差（s）和CV[7]。網織紅細胞計數百分比（reticulocyte percentage，RET%）和RET#的批內精密度要求CV≤5%[6]，熒光參數的批內精密度要求CV≤7.5%。

1.5.2 天間精密度 取近期連續2個批號的質控品，每個批號包括高、中、低值3個水平RET質控品，每天同一時間（±30 min以內）進行操作，連續觀察20 d，計算s和CV值。Sysmex在線質控：計算組內所有儀器s的平均s值，然后判斷每個儀器的s與平均s的比值即PI，以PI來反映各儀器精密度。

1.6 攜帶污染試驗

選擇紅細胞計數高值（＞6.0×1012/L）和紅細胞計數低值（＜2.0×1012/L）的標本進行紅細胞攜帶污染試驗，并選擇RET#的高值（＞200×109/L）和低值（＜10×109/L）標本進行RET%和RET#攜帶污染試驗。高值連續測3次，低值連續測3次。攜帶污染率（%）=（j1-j3）×100/（i3-j3）。式中i、j3分別是高值第一次、第3次的測定結果，i3是低值第3次的測定結果[6]。要求攜帶污染率＜2%[8-9]。

1.7 相關性比對分析（NMB染色目視計數法）

1.7.1 標本收集 常規驗證至少檢測40份標本[10]，但完整的驗證應至少檢測250～300份標本[7]，其中50%代表正常范圍標本，50%代表異常范圍標本（25%升高，25%降低）[6-7]。

1.7.2 染色與涂片準備 標本采集后2 h內進行NMB染色，然后制作至少2張血涂片，涂片要薄而均勻，紅細胞不能重疊。染色良好的涂片中可見嗜多色性略帶藍色紅細胞，其中可以看到深藍色的顆?；蚓W狀物質為RET[6，11]。

1.7.3 計數程序 手工NMB染色法鏡檢至少2 000個紅細胞（每張血涂片至少1 000個紅細胞），由2位從事臨檢專業的中級職稱或高年資檢驗技師（至少從事血液專業10年以上）對至少2張涂片分別進行顯微鏡計數，取均值（x）作為手工鏡檢的RET%結果[6，11]。以手工鏡檢結果為靶值，將SYSMEX XN-9000血液分析儀檢測的RET%結果（儀器做2次檢測，取x ）與NMB活體染色顯微鏡計數x 結果進行比對。

1.8 線性范圍驗證

選擇分析測量范圍從最低到最高的各種稀釋度，廠商提供線性范圍為RET%（0%～30%）、RET#（0～720×109/L），用RET極低值標本將接近預期上限的RET高值標本分別作100%、80%、60%、40%、20%、10%稀釋，每個稀釋濃度重復測定3次，計算[6，8]。

1.9 準確度確定

手工法與儀器法比對及參加室間質評：以參考方法（NMB染色目視計數法）測定RET，每年參加美國病理家協會（the College of American Pathologists，CAP）RET室間質評（手工法）2次，已連續參加11年，合格率100%，以手工法檢測RET%結果為靶值，取至少40份標本（含高、中、低值）進行儀器法與手工法比對，通過一致性檢驗，統計符合率、確定準確度（≥90%）。

1.1 0 正常參考區間驗證

根據廠商提供的參考區間進行驗證，首次驗證應包括至少40份無基礎疾病的體檢標本（20名男性和20名女性），符合率＞90%為驗證通過。驗證不通過的參數需建立相應的參考區間，至少120名男性和120名女性，每組應計算、s和95%可信區間，按照Dixon法刪除可能存在的離群值，若組內數據呈正態分布，則參考區間為1.96s，表示95%的可信區間分布；若數據不呈正態分布，則用百分位數法（P25和P97.5）確定參考區間[12]。

1.1 1 敏感性驗證

選擇一個正常或適度升高的標本（H），RET計數（約150×109/L），再選擇1例RET計數最低（L）可接受（約5×109/L）的標本，不要使用冷凝集標本，在骨髓活性最低點的骨髓移植后標本為最優，其RET計數約為 0.1% 或更低。要求同線性驗證要求[6]。

1.1 2 干擾評估

收集至少300份靜脈血標本，覆蓋各種影響因素和不同疾病種類，對可能存在的不同干擾因素進行分組并逐一進行一致性符合率分析，對不符合的病例進一步進行干擾研究。干擾因素主要有各種貧血，血小板增多癥，紅細胞增多癥，淋巴細胞增多癥，冷凝集，紅細胞碎片，有核紅細胞，傳染性疾病如瘧原蟲感染，服用熒光類藥物，RET%或RET#異常增高或降低，有異常RET、紅細胞、血小板散點圖和報警提示等[6]。

1.1 3 統計學方法

采用美國Stata 10統計軟件進行數據處理。相關性比對、線性、敏感性驗證采用相關性分析[6，8]，計算線性回歸方程Y?=αX+b；相關性比對采用配對t檢驗，以p＜0.05為差異有統計學意義，并進行Bland-Altman一致性檢驗[7]。采用準確性和干擾研究判斷一致性符合率，即計算手工法CV和儀器法CV，然后計算出標準誤（SEp），符合率應≥90%，具體結果見表1。手工法CV計算公式為VarR=（pR×qR）/nR，式中VarR為手工法CV、pR為手工法RET%、qR=1－pR、nR為手工法紅細胞總數；儀器法CV計算公式為VarFC=（pFC×qFC）/nFC，式中VarFC為儀器法CV、pFC為儀器法RET%、qFC=1－pFC、nFC為儀器

2 結果

2.1 批內和天間精密度

高、中、低值標本RET%、RET#、IRF、低熒光強度網織紅細胞比率（low fluorescence reticulocyte，LFR）、中熒光強度網織紅細胞比率（medium fluorescence reticulocyte，MFR）、高熒光強度網織紅細胞比率（high fluorescence reticulocyte，HFR）的批內和天間精密度均符合要求。

2.2 攜帶污染率

RET%為0.29%，RET#為0.38%，紅細胞計數絕對值為0.22%，均符合攜帶污染率要求。

2.3 相關性比對

手工法和儀器法檢測400份靜脈血標本的相關性比對呈線性相關（r2=0.972 4），線性回歸方程式為Y?=0.950 7X+0.160 8（圖1）。配對t檢驗，P=0.006 8；Bland-Altman一致性檢驗（圖1），P=0.068，2種方法檢測RET%結果差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 線性范圍驗證

RET%的直線相關回歸分析Y?=1.004 5X+0.195 8（r2=0.998 8），RET#（×109/L）的直線相關回歸分析，Y?=1.020 9X+3.184 5（r2=0.993 9）。

表1 準確度評估表

圖1 手工法與儀器法RET%結果比對

圖2 儀器法檢測RET%線性范圍驗證

2.5 準確度確定

手工法與儀器法的驗證結果根據準確度評估表（表1），統計一致性符合率為91.7 %。Sysmex在線質控系統（Sysmex network communication system，SNCS）在線質控評估對RET及其參數的準確度評價全部合格。參加上海市臨床檢驗中心RET（儀器法）室間質評，各項參數結果均合格。已參加CAP室間質評RET RT系列（手工法）連續11年，成績全部合格。

2.6 參考區間確立

根據對廠商RET%和RET#的參考區間驗證，符合率均≥90%，通過驗證。其他RET參數的廠商范圍未通過驗證，因此建立了實驗室自己的范圍。IRF、LFR、MFR呈正態分布（P＞0.05），HFR呈偏態分布（p＜0.05）。見表2。

表2 RET參考區間驗證與自建范圍建立

2.7 RET%和RET#敏感性驗證

RET%敏感性的直線相關回歸方程為Y?=1.115 4X-0.081 4（r2=0.993 8）。（2）RET#（×109/L）敏感性直線相關回歸方程為Y?=1.040 9X-1.075 9（r2=0.983 1）。

2.8 干擾評估

508例病例分析中，我們發現瘧原蟲和熒光類藥物等影響因素對RET結果產生嚴重干擾，引起RET%假性增高，并且嚴重干擾的病例都出現RET異常散點圖報警提示，瘧原蟲病例中還出現了瘧原蟲感染的報警信息。2例瘧原蟲病例中，例1患者為惡性瘧感染者，外周血涂片紅細胞感染率為20%，以大量環狀體和少量裂殖體為主，治療前儀器法RET%為8.5%，手工法RET%僅0.5%，治療后儀器法RET%結果逐漸下降，完全治愈后與手工法結果一致。例2患者為惡性瘧感染者，外周血涂片紅細胞感染率為1%，以少量配子體和環狀體為主，治療前儀器法RET%為4.6%，手工法RET%為3.9%，略有干擾，治愈后與手工法結果一致。疑似熒光藥物干擾病例中，儀器法RET%為16.7%，手工法RET%僅0.9%，同一病例連續追蹤數次，結果均類似，排除其他干擾因素后，病史顯示患者先后服用過10余種抗菌藥物和可疑熒光藥物。

在引起RET%假性增高的影響因素分組統計中，除瘧原蟲和熒光類藥物嚴重干擾RET結果外，紅細胞、血小板增多，紅細胞碎片、有核紅細胞等干擾因素的存在均能導致RET計數結果的假性增高（p＜0.05）。引起RET%假性增高的干擾因素分別為有核紅細胞（18.5%）、紅細胞增多癥（13.3%）、淋巴細胞增多癥（12.8%）、血小板增多癥（10.5%）、紅細胞凝集/冷凝集（9.5%）、Howell-Jolly小體（7.7%）、白細胞增多癥（6.7%）、血小板聚集（5.9%）、巨大血小板（5.6%）和紅細胞碎片（2.9%），其他如嗜堿性點彩紅細胞、帕彭海默小體等也會影響RET計數的結果。這些影響因素的干擾程度取決于干擾物的濃度和/或數量。

3 討論

RET及其參數在臨床的應用特別是對骨髓造血功能的評估和監測非常重要。本研究發現SYSMEX XN-9000血液分析儀對RET及其參數的檢測性能良好，但在臨床應用中仍需結合病史、儀器報警信息和血涂片鏡檢等及時發現和糾正可能存在的干擾。

在臨床工作中，我們可以通過觀察儀器的狀態是否正常（如吸樣問題）、Flag直方圖、異常散點圖或報警提示（尤其是瘧原蟲感染報警和RET異常散點圖報警，后者在嚴重干擾病例中均有出現）、平均紅細胞血紅蛋白濃度異常增高（＞360 g/L常提示可能存在冷凝集現象[2]，可37 ℃孵育或采用XN系列RET通道的紅細胞-O參數來及時糾正RET#的計數）、血涂片染色顯微鏡檢查、結合病史或歷史結果核查等發現可能存在的干擾，并且用儀器自動復檢、手工法復查等方法進行及時的糾正，以保證RET檢測的準確性和可靠性。

目前，系統評估和報告流式細胞術檢測RET的完整方法學評估，包括對干擾因素的研究，國內外研究均較少。CAP最新checklist條款中對于儀器法檢測RET提出了明確的要求，開展前需要評估干擾因素。對儀器的方法學評估既保證了RET檢測結果的可靠性，又能指導如何去發現和及時糾正可能存在的干擾。本研究中準確性和干擾因素病例研究既覆蓋了臨床實際檢測RET計數的全線性范圍，還包括了超線性濃度水平，也包含了一些異常細胞或其他可能干擾RET計數的血液成分或疾病，如大量的Howell-Jolly小體、瘧原蟲感染、淋巴細胞增多癥、血小板增多癥或紅細胞增多癥、血小板聚集、嗜堿性點彩紅細胞、大血小板、紅細胞碎片、有核紅細胞、帕彭海默小體、自發熒光類藥物、冷凝集等，其中瘧原蟲感染病例中，由于感染的紅細胞內環狀體含RNA物質，因此外周血中大量環狀體的存在對RET檢測影響較大，而配子體等相對影響較小，并且對RET檢測的干擾程度也取決于紅細胞內的感染程度和狀態。由于本研究中瘧原蟲病例較少，分析可能有一定的局限性。

另有文獻報道如使用某些藥物可能導致熒光信號終止（如蒽環類藥物）或某些病理狀態（如巴貝西蟲等其他胞內寄生蟲感染、卟啉癥、Heinz小體、異常紅細胞等）均會干擾RET的檢測結果[1，6]。由于全自動血液分析儀檢測RET可能的干擾因素眾多，本研究未能對覆蓋全部的干擾因素作一一研究，在后續臨床實踐中我們將持續跟蹤研究，包括對已知重要干擾因素增加病例繼續研究和分析，為臨床疾病診斷和檢測提供更可靠的數據和信息。

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