外周血M2/M1單核細胞比例在乳腺癌診斷中的臨床價值

杜 艷，劉 華，張波克，劉鷖雯，何怡青，楊翠霞，張國良，高 鋒

（1.上海交通大學附屬第六人民醫院檢驗科，上海 200233 2.上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海 200233）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，目前臨床診斷乳腺癌的方法主要依賴于體格檢查和影像學檢查，但這些方法對于早期乳腺癌的發現敏感性很低。而目前常用來診斷乳腺癌的血清標志物——癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）對乳腺癌早期診斷的敏感性和特異性均不理想，因此尋找新的腫瘤標志物迫在眉睫[2]。

單核細胞由骨髓釋放入血，在血中3～4 d后進入組織和漿膜腔轉變成巨噬細胞。腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）在腫瘤的發生、發展中發揮了重要作用。有研究表明，TAM在腫瘤組織中通常具有2種功能截然不同的極化狀態，即M1和M2。M1型巨噬細胞一般出現在腫瘤發生的早期、良性病變以及癌巢周圍組織中，具有殺傷腫瘤細胞、促進炎癥反應等功能；M2型巨噬細胞存在于整個腫瘤的發生、發展過程中，具有促進腫瘤生長、血管形成、腫瘤轉移等功能[3]。TAM的極化是一個動態發展的過程，根據腫瘤的進展，TAM可受腫瘤微環境異常改變的透明質酸作用而發生M2極化[4]。既往有研究證實，TAM能夠伴隨著癌細胞穿過腫瘤組織內的毛細血管壁進入外周血循環[5-6]。因此，外周血循環中M2/M1單核細胞比例的動態變化可能對乳腺癌的診斷具有重要意義。

近年有研究顯示，結直腸癌以及霍奇金淋巴瘤等患者的外周血M2單核細胞水平升高[7-8]，結直腸癌患者外周血和組織中M1單核及巨噬細胞并沒有明顯改變[7]。目前已知乳腺癌組織中M2型巨噬細胞增多，且與腫瘤進展呈正相關[4]。但關于乳腺癌患者外周血M2/M1單核細胞比例變化的研究尚未見報道。因此，本研究試圖通過采用流式細胞術分析乳腺癌患者外周血M2/M1單核細胞比例變化，并與乳腺癌常規的腫瘤標志物（CEA、CA15-3）進行對比，分析外周血M2/ M1單核細胞比例對乳腺癌的臨床診斷價值。

1 材料和方法

1.1 外周血標本的收集

收集2017年1—6月上海交通大學附屬第六人民醫院住院的乳腺癌患者術前的乙二胺四乙酸抗凝外周血標本89例，患者年齡（51.05±10.12）歲，既往無腫瘤感染性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤等疾病，且術前均未接受放療、化療及藥物治療。選取體檢健康者53名，年齡（50.50±7.78）歲。血液標本的收集符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》（2013版）的原則，全部研究對象知情同意。

1.2 主要試劑

異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的CD14抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的CD86抗體購自美國Beckman Coulter公司；別藻藍蛋白（allophycocyanion，APC）標記的CD163抗體購自美國Biolegend公司；PE標記的CD204抗體購自美國R&D公司。

1.3 流式細胞術檢測外周血中M1、M2單核細胞

采用全血標本100 μL，一管同時加入CD14、CD163、CD204抗體檢測M2單核細胞（CD14+CD163+CD204+），另一管同時加入CD14、CD163、CD86抗體檢測M1單核細胞（CD14+CD163-CD86+），振蕩混勻，室溫避光反應25 min；加入2 mL 熒光激活細胞分離儀溶血劑，振蕩混勻，室溫避光放置10 min；加入300 μL 1%（質量分數）多聚甲醛；于2～8 ℃暗處保存，24 h內上機分析。

1.4 血漿CEA、CA15-3的檢測

使用乙二胺四乙酸抗凝血液收集血漿。將收集管里的血液標本1 900 × g 4 ℃離心10 min。將血漿轉移至Eppendorf管中，12 000×g 4 ℃離心10 min，去除細胞來源碎片。將上清移至新的Eppendorf管中，凍存于-80 ℃。檢測前，將其在室溫下溶解，將溶解好的血漿樣本在16 000×g 4 ℃離心5 min，吸取上清，根據試劑盒使用說明書在Cobas 6000化學發光分析儀（瑞士Roche公司）上進行CEA、CA15-3檢測。

1.5 統計學方法

使用SPSS 20.0軟件進行統計分析。正態分布的數據以表示，2組樣本之間的比較采用兩獨立樣本Student's t檢驗。非正態分布數據以中位數（四分位數） [M（P25～P75）]表示，2組樣本的統計學比較采用Mann-Whitney U檢驗。M2/M1單核細胞比例診斷乳腺癌敏感性和特異性的評價用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測乳腺癌患者及體檢健康者外周血中M2、M1單核細胞的表達

本研究試圖從外周血中檢測M2和M1單核細胞。首先以前角散射光和側角散射光的中間細胞群設門，再以CD14+細胞群設門，M2單核細胞分析CD163+CD204+雙陽性細胞，M1單核細胞分析CD163-CD86+細胞，見圖1（a）。結果顯示乳腺癌患者外周血CD14+CD163+CD204+的M2單核細胞（5.88±1.31）較體檢健康者（3.70±1.00）增加（p＜0.05），見圖1（b）。乳腺癌患者外周血CD14+CD163-CD86+的M1單核細胞（27.89±5.69）較體檢健康者（33.83±5.80）減少（p＜0.05），見圖1（c）。

圖1 乳腺癌患者及體檢健康者外周血M2、M1單核細胞的表達

2.2 乳腺癌患者與體檢健康者外周血M2/M1單核細胞比例、CEA及CA15-3差異的分析

基于M2單核細胞與M1單核細胞之間存在動態轉換，本研究進一步分析了外周血M2/M1單核細胞比例變化。發現乳腺癌患者與體檢健康者外周血M2/M1單核細胞比例差異有統計學意義（p＜0.001）。同步分析了血漿CEA、CA15-3的水平差異，發現CA15-3在乳腺癌患者與體檢健康者之間差異有統計學意義（p＜0.05），而CEA表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表1。

圖2 各組M2/M1單核細胞比例與血清CEA、CA15-3水平的比較

表1 乳腺癌患者與體檢健康者M2/M1單核細胞比例等指標的比較

2.3 M2/M1單核細胞比例的ROC曲線分析

經ROC曲線分析發現，外周血M2/M1單核細胞比例所對應的ROC曲線的曲線下面積大于CEA和CA15-3。見圖3。

圖3 M2/M1單核細胞比例、CEA和CA15-3診斷乳腺癌的ROC曲線

3 討論

惡性腫瘤的進展是一個極其復雜的多步驟、多因素過程，越來越多的數據證明，在實體瘤的微環境中浸潤了大量TAM。TAM具有明顯的表型可變性和功能多樣性。在乳腺腫瘤微環境中，TAM極化成經典激活的M1型巨噬細胞和選擇性激活的M2型巨噬細胞[9]。有研究提示隨著腫瘤進展，TAM以M2型為主，主要發揮抑制炎癥，促進組織修復及促進腫瘤細胞生長、侵襲、轉移等作用[3]。既往認為血液中的單核細胞進入組織轉變為巨噬細胞后，一般不再返回血液循環，但近年來發現腫瘤組織中的TAM能夠進入外周血，引起外周血該類細胞的增加，鑒于TAM的不同極化類型與腫瘤的密切關系，分析外周血單核細胞極化差異很可能成為一種新的腫瘤診斷指標。前期研究發現在非小細胞肺癌和結直腸癌患者外周血中以M2單核細胞為主，M2單核細胞能夠作為一種診斷實體瘤的生物標志物[10，7]。最新研究提示乳腺癌外周血同樣以M2單核細胞為主[11]，但現有的關于TAM表型的臨床數據非常有限，鮮有報道分析外周血M1單核細胞的表達情況以及M2與M1單核細胞比例的動態轉化。根據TAM 2種極化狀態可因環境的改變而相互轉換的特性，本研究綜合分析M2/ M1單核細胞比例變化在乳腺癌患者與體檢健康者之間的差異。本研究發現乳腺癌患者外周血M2/M1單核細胞比例（0.166±0.110）明顯高于體檢健康者（0.090±0.032）（p＜0.001）。

目前，已知CEA和CA15-3是診斷乳腺癌的常用腫瘤標志物，但由于敏感性和特異性較低，CEA與CA15-3并不適合應用于乳腺癌的早期診斷[12-13]。本研究結果表明，乳腺癌患者血漿CA15-3水平高于體檢健康者，而CEA水平在乳腺癌患者和體檢健康者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究將M2/M1單核細胞比例數據與CEA、CA15-3表達水平進行比較分析，發現M2/M1單核細胞比例對于乳腺癌的診斷價值優于CEA及CA15-3。因此，就診斷乳腺癌而言，外周血M2/M1單核細胞比例的診斷潛能要優于CEA和CA15-3。

本研究結果表明，外周血M2/M1單核細胞比例可能作為一種非創傷性的新的診斷乳腺癌的腫瘤標志物。然而本研究仍然存在一些不足之處：首先，外周血M2、M1單核細胞所選擇的表型標志物有限，本研究僅選擇CD163+CD204+來反映M2單核細胞的表達情況，選擇CD163-CD86+來反應M1單核細胞的表達情況；其次，本研究選取的樣本量較少，需進一步擴大樣本量來驗證本研究的結果。

從外周血中發現敏感、特異的腫瘤標志物用于腫瘤的早期診斷是近年腫瘤診斷學的一個熱點。本研究用流式細胞術比較了外周血M2/M1單核細胞比例在乳腺癌患者和體檢健康者間的表達差異，并用ROC曲線評價其診斷性能，同時與臨床較常用的腫瘤標志物進行了比較分析。結果提示M2/M1單核細胞比例是一種十分有效的乳腺癌循環腫瘤標志物，但其臨床應用價值還需結合臨床病理資料進行更深入的評價。

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