運用CLSI EP7-A2文件評價溶血對血糖檢測的影響

沈建江， 符布清， 趙 春， 徐 天

（江蘇省中醫院檢驗科，江蘇 南京 210029）

目前，溶血樣本占不合格樣本總量的60%左右，是臨床實驗室退回樣本的主要原因[1-2]。但對一些特殊情況的檢查，如葡萄糖耐量試驗，由于其抽血時間有著嚴格的規定，餐后每次樣本都是唯一且不可替代的。雖然現在臨床常用的己糖激酶（hexokinase，HK）法有著良好的抗溶血干擾能力，但一旦溶血程度嚴重，極有可能造成結果的不準確。在美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件中，有2種干擾評價方案（配對差異實驗和劑量效應實驗）可供使用。將潛在的干擾物質添加至檢測樣本中，評價其相對于未加干擾物質的對照組的偏移，即配對差異實驗。若引起的偏移有顯著臨床意義，則為干擾物質，應進一步評價，證實干擾程度與干擾物濃度的關系，即劑量效應實驗。本研究采用CLSI EP7-A2文件中的2種干擾評價方案確定溶血對葡萄糖（glucose，Glu）測定是否有干擾以及溶血達到什么程度會對結果產生干擾，進而給臨床醫生提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集江蘇省中醫院體檢當天無黃疸、溶血、脂血的剩余血清樣本，制備成混合血清，Glu濃度高值為11.1 mmol/L、中值為7.0 mmol/L。

1.2 儀器與試劑

AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman-Coulter公司）。葡萄糖測定試劑盒（HK法，批號1216071）、校準品（批號0417021）購自四川邁克生物科技股份有限公司，質控品購自伯樂生命醫學產品（上海）有限公司。檢測前儀器情況良好，用校準品校準Glu項目，并且質控在控。

1.3 干擾物貯存液配制[3]

依據CLSI EP7-A2文件要求，制成100 g/L血紅蛋白（hemoglobin，Hb）貯存液。

1.4 配對差異實驗

1.4.1 樣本制備 （1）基礎樣本：取Glu濃度為7.0、11.1 mmol/L的血清作為基礎樣本；（2）測試樣本和對照樣本：基礎樣本以19︰1的比例稀釋Hb溶液作為測試樣本，稀釋后測試樣本的Hb濃度為5 g/L。以生理鹽水作為對照樣本。

1.4.2 檢測次數的計算 計算出允許的最大干擾值（dmax）/批內標準差（s）的值，利用dmax/s與檢測次數對應表[3]得出2個濃度的檢測次數。s由基礎樣本連續測定20次計算得出，dmax為美國臨床實驗室改進修正法規（the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988，CLIA'88）規定的允許誤差的1/3，定義為T±3.33%。

1.4.3 檢測要求 為避免攜帶污染，增加額外樣本Cx（去離子水），按如下順序檢測：C1T1CxCxC2T2CxCx……CxCxCnTn，其中C為對照樣本、T為測試樣本。

1.4.4 干擾效應評估 計算出dobs（測試樣本均值-對照樣本均值），與甄別值dc比較，若dobs≥dc，則存在干擾。dc在雙側檢驗時可通過公式計算得出：dc=（dnull+sZ1-α/2）式中dnull是無效假設規定的值，通常為0；s為批內標準差，Z1-α/2是從相應的標準正態分布到雙側檢驗中100（1-α）%的可信區間水平，n為重復測定次數。

1.5 劑量效應試驗

1.5.1 樣本準備 （1）干擾物高濃度（H）及低濃度（L）樣本：樣本制備方式同配對差異實驗；（2）測試樣本：按照L、3/4L+1/4H、1/2L+1/2H、2/4L+3/4H、H進行配制。

1.5.2 測定次數 共測定3次，第1次由低濃度到高濃度，第2次由高濃度到低濃度，第3次由低濃度到高濃度。

1.5.3 劑量效應分析 （1）線性效應：如果數據成一條直線，可進行線性回歸分析，在圖上繪制回歸線；（2）非線性效應：若各濃度在作圖時顯示非線性，利用非線性回歸評估干擾物的干擾濃度。

2 結果

2.1 配對差異試驗

2.1.1 重測次數的確定 中、高濃度基礎樣本20次測定的Glu均值分別為6.95、 10.88 mmol/L，dmax分別為0.23、0.36 mmol/L，s分別為0.044、0.105 mmol/L。中、高濃度Glu的dmax/s均＞3，測定次數均為3次。

2.1.2 干擾效應分析 中、高濃度Glu的dobs分別為0.77、0.93 mmol/L，dc分別為0.05、0.12 mmol/ L，dobs均＞dc，表明5 g/L Hb對Glu測定存在干擾。

2.2 劑量效應實驗

依據劑量反應干擾測試程序[3]，Hb對Glu測定產生非線性正干擾，見表1。中濃度Glu的非線性方程為Y=6.496+0.160 5X-0.013 10X2（r2=0.983）；高濃度Glu的非線性方程為Y=10.13+0.211 0X-0.017 83X2（r2=0.973），見圖1、圖2。

表1 Hb對Glu檢測的干擾劑量效應結果

圖1 Hb對中濃度Glu干擾的劑量效應圖

圖2 Hb對高濃度Glu干擾的劑量效應圖

3 討論

由于居民生活水平的不斷提高，我國的糖尿病患病率已躍居全世界第2位，其發病率和死亡率呈持續增長趨勢[4-5]。很多糖尿病患者 “三多一少”癥狀并不明顯，因此初期診斷是當前防治糖尿病的難點與重點。糖耐量減低是糖尿病的最早期階段。臨床診斷糖尿病都從篩查糖耐量減低開始。目前，臨床常用口服葡萄糖耐量試驗（oral glucose tolerance test，OGTT）監測空腹及餐后血糖，但由于需多次、不同部位采血，容易因抽血不暢而導致樣本溶血。OGTT在不同時間點的采血有嚴格的定義，一旦出現樣本溶血，退回重采的可能性很低。因此，溶血對Glu測定的影響，尤其是在醫學決定水平處的偏差可能會導致臨床醫生誤判病情。

本研究采用CLSI EP7-A2文件分析了溶血對Glu測定結果的影響。結果顯示5 g/L Hb對Glu測定有明顯正干擾，可能與溶血導致的Hb干擾或細胞內容物釋放有關[6]。Hb在主波長340 nm處有明顯的吸收峰，會干擾速率法中的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸檢測系統[7]。本研究結果顯示，隨著Hb濃度的增加，Glu的結果也呈假性增高。為避免該情況引起臨床醫生對患者病情的誤判，我們利用AU5800全自動生化分析儀的溶血指數測定功能，判斷樣本的溶血程度。AU5800全自動生化分析儀的溶血指數標記如下：N為Hb＜0.50 g/ L，+為0.50 ～0.99 g/L，++為1.00～1.99 g/L，+++為2.00～2.99 g/L，++++為3.00～5.00 g/ L，+++++為＞5.0 g/L。依據本研究定義的dmax（T±3.33%），中、高濃度Glu允許的檢測結果上限均處于Hb 1.25～2.5 g/L之間，即溶血指數++及以上的樣本，其Glu檢測結果均不可接受。由于肉眼判斷溶血及溶血程度與儀器測定的溶血指數往往有著明顯的差異[8]，因此檢驗工作人員發出報告時應充分利用儀器的溶血指數功能，在報告單上明確說明樣本的溶血程度，當溶血為++及以上時，應在檢測報告上注明結果偏高，數值僅供臨床參考。

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[3]Clinical and Laboratory Standards Institute.Interference testing in clinical chemistry[S]. EP7-A2，CLSI，2002.

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