MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數的臨床價值

董海波， 曾 慧， 張啟國， 周 敏， 袁翠英， 陳 兵

（南京大學醫學院附屬鼓樓醫院血液科，江蘇 南京 210008 ）

CD34+抗原是唾液酸黏蛋白樣Ⅰ型跨膜磷酸糖蛋白，是一種高度糖基化分子，該抗原在人類造血干細胞、祖細胞表面選擇表達[1]。如果造血功能穩定，造血干細胞很少在骨髓與外周血循環間交換，但有許多因素可導致骨髓CD34+細胞向外周血循環遷移[1-2]。已有研究結果表明，急性白血病、骨髓纖維化等惡性血液病患者外周血循環CD34+細胞計數存在異常增加現象[3-5]。另有研究結果表明，骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）患者外周血循環CD34+細胞計數不僅存在異常增加現象，而且與疾病危險度分組、染色體核型、國際預后積分系統（the International Prognostic Scoring System，IPSS）預后積分等指標相關。隨著研究工作的深入，有學者發現即使疾病在低危階段，即難治性貧血（refractory anemia，RA）/難治性貧血伴環形鐵粒幼細胞增多（refractory anemia with ring sideroblasts，RARS）/難治性貧血伴多系異常（refractory cytopenia with multilineage dysplasia，RCMD）階段，MDS患者外周血循環CD34+細胞計數亦可出現增加的情況[6-8]。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2009年2月—2015年6月于南京大學醫學院附屬鼓樓醫院血液科就診的52例MDS患者（男30例、女22例），年齡15～84歲。根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）MDS診斷標準，所有患者均為MDS-RA/RARS/RCMD。另選取19名造血干細胞供者（男11名、女8名）為正常對照者，年齡22～38歲。

1.2 方法

1.2.1 外周血循環CD34+細胞計數檢測 采用FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）進行檢測。鞘液使用ISOTON Ⅲ血細胞稀釋液（美國Beckman公司）。使用ProCOUNT 試劑盒（美國BD公司，批號為340498），該試劑盒配有核酸染料、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的CD34單抗（抗HPCA22），多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質復合物（peridinin-chlorophyllprotein complex，PerCP）標記的CD45 單抗（抗HLe2l），PE標記的同型對照IgG1。抽取患者、正常對照者靜脈血2 mL，運用乙二胺四乙酸管進行抗凝處理。取含有定量熒光微球的TruCOUNT管2支，分別標記為測定（test，T）管、對照（control，C）管。T管中加入核酸染料/CD34 2PE/CD45 2PerCP試劑20 μL，C管中加入核酸染料/IgG1 2PE/CD45 2PerCP試劑20 μL。采用反向加樣法，分別加入標本50 μL（應預先對加入標本進行處理，將其有核細胞水平調整為15×109/L左右），混勻，室溫、避光染色15 min。加溶血素450 μL，室溫、避光放置30 min，旋渦混合器混勻5 s，上機檢測，運用ProCOUNT軟件分析數據。

1.2.2 染色體檢測 取肝素抗凝骨髓5 mL，采用直接法、24 h培養法和同步法制備染色體。采用R帶技術顯帶，描述核型。根據IPSS預后積分，對MDS-RA/RARS/RCMD患者染色體核型進行分組。染色體良好核型組包括正常染色體核型、-Y、5q-、20q-；染色體不良核型組包括復雜染色體核型異常（異常≥3種）、7號染色體核型異常；染色體中間核型組包括除上述2類以外的其他染色體核型異常。

1.2.3 其他檢查 所有患者均接受血常規檢查、骨髓涂片檢查和骨髓活檢。

1.3 IPSS預后積分及疾病危險度分組

根據骨髓原始細胞百分比、骨髓造血細胞染色體核型和外周血細胞減少系列數進行計分。0分計為低危，0.5～1.0分計為中危Ⅰ，1.5～2.0分計為中危Ⅱ，≥2.5分計為高危。

1.4 WHO分型預后積分系統（WHO-Based Prognostic Scoring System，WPSS）預后積分及疾病危險度分組

根據WHO亞型、骨髓造血細胞染色體核型和有無輸血依賴進行計分。0分計為極低危，1分計為低危，2分計為中危，3～4分計為高危，5～6分計為極高危。

1.5 統計學方法

使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。采用Pearson χ2檢驗以及 Fisher精確檢驗進行統計分析。以p＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MDS-RA/RARS/RCMD患者與正常對照者外周血循環CD34+細胞表達

正常對照者外周血循環CD34+細胞百分比和計數[中位數（范圍）]分別為0.04%（0.01%～0.14%）、[1.75（0.90～4.69）]×106/L，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞百分比和計數[中位數（范圍）]分別為0.14%（0.01%～7.35%）、[3.01（0.17～208.00）]×106/L。MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞百分比和計數均高于正常對照者（p＜0.01）。所有正常對照者外周血循環CD34+細胞計數均＜10.00×106/L。見圖1、圖2。

2.2 MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數與臨床特點

MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數與性別、年齡、外周血血細胞減少程度、白細胞計數下降、幼稚前體細胞異常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）現象均無相關性（r＜0.625，P＞0.05），而與染色體核型異常、IPSS預后積分、WPSS預后積分、骨髓纖維化相關（r＞0.995，p＜0.01）。外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L的 MDSRA/RARS/RCMD患者共有16例，其余36例外周血循環CD34+細胞計數＜10.00×106/L。

外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L的16例MDS-RA/RARS/RCMD患者中，有12例伴有復雜染色體核型異常（異常≥3種），其中10例伴有7號染色體核型異常；有12例IPSS預后積分為中危Ⅱ；有13例WPSS預后積分為高危； 9例伴有骨髓纖維化。

36例外周血循環CD34+細胞計數＜10.00×106/ L的MDS-RA/RARS/RCMD患者均不伴有復雜染色體核型異常及7號染色體核型異常；所有患者IPSS預后積分均為低危或中危Ⅰ；除1例患者WPSS預后積分為高危外，其余患者的WPSS預后積分均為極低危、低危或中危；除1例患者伴有骨髓纖維化外，其余患者均不伴有骨髓纖維化。見圖3。

圖1 正常對照者與MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞百分比

圖2 正常對照者與MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數

圖3 外周血循環CD34+細胞計數與MDS-RA/RARS/RCMD患者臨床特點示意圖

3 討論

CD34+抗原主要在人類造血干細胞、祖細胞階段呈特異性表達。隨著造血細胞的不斷成熟，CD34+抗原表達逐漸減弱，直至消失。在穩定的造血情況下，該抗原在有核循環血細胞上表達極低，約占未經動員外周血單個核細胞的0.2%[9]。藥物誘導的干細胞動員、急性白血病、骨髓纖維化等均可導致骨髓CD34+細胞向外周血循環遷移[10]。

國內外研究工作已證實MDS患者外周血循環CD34+細胞計數存在異常增加現象，而且與疾病危險度分組、不良細胞遺傳的出現、白血病相關生存率、IPSS預后積分等具有相關性，是急性白血病的早期信號。當患者處于RA/RARS/RCMD階段，即“低危”階段時，其外周血循環CD34+細胞計數往往＜10.00×106/L，而大多數“高危” 難治性貧血伴原始細胞增多（refractory anemia with excess blast，RAEB）階段的MDS患者外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L，且隨著疾病危險度的升高，外周血循環CD34+細胞計數亦逐漸增加。當對疾病狀態、預后分組進行判斷時，外周血循環CD34+細胞計數較CD34+細胞百分比更敏感。KNIPP等[11]研究使用10.00×106/L作為初診MDS患者外周血循環CD34+細胞計數的臨界值，可較好地鑒別疾病“低危”“高危”狀態。

對急性白血病，尤其是對急性早幼粒細胞白血病的研究發現，急性早幼粒細胞白血病患者外周血循環CD34+細胞計數均＜10.00×106/L。隨著研究工作的深入，有學者發現，部分急性早幼粒細胞白血病患者外周血循環CD34+細胞計數亦可出現＞10.00×106/L的情況，此類患者往往具有一種或多種諸如復雜染色體核型異常、FLT3-ITD基因陽性突變、PML/RARa融合基因復雜融合、高白細胞計數的不良預后因素。當把MDS限定在RA/RARS/RCMD“低危”階段時，多數MDS患者外周血循環CD34+細胞計數符合既往研究規律，即＜10.00×106/L。部分急性早幼粒細胞白血病RA/RARS/RCMD階段患者外周血循環CD34+細胞計數可＞10.00×106/L。進一步研究發現該細胞計數的多少與患者性別、年齡、外周血細胞減少程度、白細胞計數下降、ALIP現象均無相關性，而與染色體核型異常、IPSS預后積分、WPSS預后積分、骨髓纖維化等不良預后因素有關[6-8]。

克隆性染色體核型異常是MDS最主要的克隆性造血證據，不僅是MDS的確診條件之一，還是MDS患者的獨立預后因素，不同染色體核型預后分組是確定不同治療方案的主要依據。復雜染色體核型異常尤其是7號染色體核型異常是MDS的高危預后因素。具有上述染色體核型異常的MDS患者，疾病更易進展，并易向急性白血病轉化，常規治療方案效果差，臨床需采取更為積極的治療策略[12-13]。本研究發現，外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，有75.0%（12/16）伴有復雜染色體核型異常（異常≥3種），并且其中83.3%（10/12）的患者為7號染色體核型異常，并伴有其他染色體核型異常。這一結果表明，MDSRA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L提示患者可能具有不良染色體核型，疾病轉化為白血病的可能性較大，患者中位生存期短，預后不良。然而，外周血循環CD34+細胞計數未＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者，不伴有復雜染色體核型異常。

近年來，常用IPSS及WPSS對疾病危險度進行分組，并為MDS治療提供了準確的指導方向。隨著預后積分的升高，患者中位生存期及疾病向白血病轉化的時間縮短。IPSS預后積分為中危Ⅱ和高危的MDS患者與WPSS預后積分為高危和極高危的MDS患者，往往疾病惡性程度高、預后不良，臨床醫師應采用更為行之有效的化療方案[14]。本研究發現外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者中分別有75.0%（12/16）及81.3%（13/16）的患者IPSS預后積分為中危Ⅱ及WPSS預后積分為高危，而外周血循環CD34+細胞計數未 ＞10.00×106/L的MDS-RA/RARS/RCMD患者IPSS預后積分均為低危或中危Ⅰ，除1例WPSS預后積分為高危外，其余患者的WPSS預后積分均為極低危、低危或中危。

MDS患者除了有骨髓病態造血的情況外，還可能伴有骨髓纖維化。MDS伴有骨髓纖維化是疾病的獨立不良預后因素[15]。本研究發現52例MDS-RA/RARS/RCMD患者10例伴有骨髓纖維化，其中9例患者外周血循環CD34+細胞計數 ＞10.00×106/L，而外周血循環CD34+細胞計數未＞10.00×106/L的患者僅有1例伴有骨髓纖維化。

綜上所述，MDS-RA/RARS/RCMD患者外周血循環CD34+細胞計數可出現異常增加，外周血循環CD34+細胞計數＞10.00×106/L的患者多伴有復雜染色體核型異常，疾病危險度高，預后不良。外周血循環CD34+細胞計數檢測方便、簡單，患者痛苦小，有助于對MDS患者疾病危險度的進一步分層，具有一定的臨床實用價值。

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