傷科紫草油微生物限度檢查方法的驗證

趙毛香 黃曉冰鐘碧蓮 王 凌

（廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院藥學部，廣東 廣州 510375）

傷科紫草油為我院注冊制劑，主要成分為紫草、大黃、白及等，具有清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，臨床用于跌打損傷、骨折腫痛、軟組織損傷及燙傷未潰等，療效確切，不良反應少[1]。為了有效控制傷科紫草油的質量，保證微生物限度檢查結果的準確性，確保方法的科學性，本文根據 《中華人民共和國藥典》2010年版一部附錄微生物限度檢查方法的要求[2]，對傷科紫草油微生物限度檢查方法進行驗證，驗證內容包括細菌、霉菌和酵母菌的計數方法，以及金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等控制菌檢查方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 電子分析天平 （JA1103），臺式滅菌器（MOST-T），臺式高速離心機 （TGL-16G），干熱滅菌器（BOS-150）， 生化培養箱 （LRH-70）。

1.2 菌種 金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63501]、白色念珠菌 [CMCC(F)98001]、黑曲霉菌 [CMCC(F)98003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌 [CMCC(B)10104]，購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養基 營養肉湯培養基、膽鹽乳糖培養基、改良馬丁培養基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、卵黃氯化鈉瓊脂培養基，購于廣東環凱公司。

1.4 稀釋劑 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%的無菌氯化鈉溶液，按2010年版 《中華人民共和國藥典（一部）·附錄》方法配制。

1.5 樣品 傷科紫草油 （批號：110801、110802、110803），由廣州中醫藥大學附屬骨傷科醫院制劑室生產。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備 取金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌接種至營養肉湯中，置于37℃培養箱中培養24 h，白色念珠菌接種至改良馬丁培養物，25℃培養24 h。上述菌種各取1 mL，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液9 mL，稀釋至菌懸液濃度為50～100 cfu/mL。黑曲霉采用斜面培養，置于20℃培養箱培養1周后加3～5 mL 0.9%的無菌氯化鈉溶液 （含0.05%聚山梨酯80），洗下霉菌孢子，取孢子菌液，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液 （含0.05%聚山梨酯80）稀釋為50～100 cfu/mL的孢子懸液。

2.2 供試液的制備 取本品10 mL，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖5 min，混勻，作為1∶10的供試液。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌計數方法的驗證

2.3.1 試驗組 分別取1 mL供試液和試驗菌液，菌液濃度為50～100 cfu/mL，采用平皿培養法，平行制備2個平皿，根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗。

2.3.2 菌液組 取1 mL試驗菌液，菌液濃度為50～100 cfu/mL，采用平皿培養法，平行制備兩個平皿，根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗，測定試驗中加入的活菌數。

2.3.3 供試品對照組 取供試液，根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法試驗，測定供試品本底菌數。

各試驗菌開展獨立的平行試驗，分別進行3次，計算每次試驗的回收率。各菌株回收率=(試驗組菌落數-供試品對照組菌落數)/菌液組菌落數×100%。結果見表1。

表1 傷科紫草油細菌數、霉菌和酵母菌數計數驗證結果

從表1可以看出：傷科紫草油根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展方法學驗證試驗，結果表明供試品5種菌回收率均符合藥典規定的大于70%的要求，證明本品無明顯抑菌作用，傷科紫草油可采用常規方法進行微生物限度檢查。

2.4 控制菌 （金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢查方法的驗證

2.4.1 陽性對照組 取10 mL供試液、1 mL金黃色葡萄球菌試驗菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時采用120 mL營養肉湯培養基直接培養；取10 mL供試液、1 mL銅綠假單胞菌試驗菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時采用120 mL膽鹽乳糖培養基直接培養。根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展試驗。

2.4.2 陰性菌對照組 取10 mL供試液、1 mL大腸埃希菌試驗菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時采用120 mL營養肉湯培養基直接培養；取10 mL供試液、1 mL大腸埃希菌試驗菌液 （濃度為50～100 cfu/mL），同時采用120 mL膽鹽乳糖培養基直接培養。根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法開展試驗。

2.4.3 供試品對照組 取供試液適量，根據2010年版《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法的要求，采用常規檢查法對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌進行檢查。

各試驗菌開展獨立的平行試驗，分別進行3次，試驗結果見表2。

表2 傷科紫草油控制菌常規檢查法驗證結果

由表2可知，陽性對照組檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，陰性菌對照組和供試品對照組均未檢出，表明可用常規法對傷科紫草油進行控制菌檢查。

3 成品微生物限度檢查

取3批傷科紫草油，根據2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》微生物檢查方法的要求，采用常規方法進行檢查。檢驗結果見表3。

表3 傷科紫草油微生物限度檢查結果 （cfu/mL）

由表3可知，對傷科紫草油采用常規法進行微生物限度檢查，結果均符合2010年版 《中華人民共和國藥典 （一部）·附錄》中搽劑微生物限度標準。

4 討論

藥品微生物限度檢查是控制藥品質量的一項重要指標，為了保證方法的可靠性，使實驗結果盡可能與藥品中所含微生物的真實值接近，必須根據2010年版《中華人民共和國藥典》的規定進行方法驗證[3]。

微生物限度方法學驗證試驗中所用的標準菌種的傳代次數不得超過5代，并需要定期進行菌種鑒定，以檢查菌種有無變異或污染，保證驗證結果的準確性。枯草芽孢桿菌在平皿上生長時容易粘連成片，影響計數，可將50～100 cfu菌液于平皿上充分點散開，倒入瓊脂后充分搖勻，菌落呈點狀，易于計數[4]。

跌打損傷、骨折腫痛、軟組織損傷及燙傷未潰等，治宜清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛。傷科紫草油是由多味中藥制成的復方制劑，方中紫草性味苦寒，有清熱涼血、活血解毒、透疹消斑之功效，為主藥；輔以大黃涼血解毒、瀉下攻積、逐瘀通經；佐以冰片芳香走竅，清熱止痛。諸藥合用，共奏清熱涼血，活血解毒，逐瘀止痛等功效，臨床上使用多年，療效顯著，期間未發現相關不良反應報告。

中藥成分復雜，對制劑成品中的微生物可能存在一定的抑制作用[5]，在開展中藥制劑微生物質量檢查中應進行方法學驗證，以確定采用的方法的科學性，確保方法的準確性。傷科紫草油作為一種處方組方復雜的中藥制劑，存在控制菌的潛在污染，本研究按照2010年版 《中華人民共和國藥典》的規定，對傷科紫草油的微生物限度檢查方法進行驗證，確定了傷科紫草油的微生物限度檢查方法，保證了方法的科學性和準確性，從而確保藥品的質量安全，同時為我院醫院制劑質量標準的修訂和完善提供了一定的參考。

[1]胡超燕.傷科紫草油治療閉合性骨質并發張力性水泡的療效研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2015.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄 79-88.

[3]嚴曉明，劉萌，朱燕.四種醫院制劑微生物限度檢查方法學驗證[J].中國藥事，2015，29（5）:485-491.

[4]李卓亞，袁繼承.散結止痛顆粒微生物限度檢查方法的驗證[J].海峽藥學，2017，29（6）:37-38.

[5]李建志，王曉源，王亞賢.8種中草藥抗菌作用實驗研究[J].中醫藥信息，2015，32(1)：32-34.