ATP及P2X7受體在三伏灸治療支氣管哮喘的作用機制研究※

陳 銘 康佩芝 董亞琴

（1福建衛生職業技術學院臨床醫學系，福建 福州 350101；2福建省中醫藥研究院福建省經絡感傳重點實驗室，福建 福州 350003）

支氣管哮喘是常見的慢性疾病之一。我們前期的實驗則表明三伏灸可通過抑制MMP-9的合成，使支氣管哮喘新西蘭兔細支氣管平滑肌厚度及細支氣管內管壁厚度明顯變薄，從而顯著改善氣道重塑現象而達到治療效果[1-2]。本文通過進一步觀察三伏灸對ATP和P2X7受體的影響，探討三伏灸治療支氣管哮喘的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭兔18只，雄性，體質量 （2.5±0.3）kg，由福建醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK （閩） 2012-0001。

1.1.2 試劑、藥物及儀器 卵白蛋白 (Ovalbumin，OVA)（美國Sigma公司）；氫氧化鋁 (Aluminum hydroxide，AL(OH)3) （西隴化工股份有限公司）；異氟烷 （瑞沃德公司）；甲醇 （色譜純，默克股份兩合公司），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 （色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司），ATP、ADP、AMP、ADO （西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司），實驗用水超純水；RNA提取液（武漢谷歌生物科技有限公司）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（HyClone公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo公司）；FastStart U-niversal SYBR Green Master(Rox) （Roche公司）； 引物（武漢谷歌生物科技有限公司）P2RX7上游引物：5’-CCACAGTCTCAATCACCCACAA-3’，下游引物：5’-CCACACATCCTCCCCTATCC-3’，待擴增產物長度191bp。GAPDH上游引物：5’-CCGCCCAGAACATCATCCCT-3’，5’-GCACTGTTGAAGTCGCAGGAGA-3’， 待擴增產物長度262 bp。

ACQUITY超高效液相色譜儀 （waters公司）；SB-5200DT超聲波清洗機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿有限公司）；BP211型電子天平稱 （德國Sartorius公司）；DL-200微型掌上離心機 （北京東林昌盛生物科技有限公司）；ESP-32微透析注射泵 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司），瑞沃德呼吸系統 （瑞沃德公司）。勻漿儀（康濤科技）；臺式高速冷凍型微量離心機 （DragonLab公司）；熒光定量PCR儀 （ABI公司）；超凈工作臺 （蘇凈安泰公司）；超微量分光光度計 （Thermo公司）；標準試劑型純水儀 （青島富勒姆科技有限公司）。

1.2.1 動物分組、造模及干預方法 18只新西蘭兔適應性飼養1周后，采用隨機數字表法隨機分為空白組，模型組，治療組，每組6只。除空白組外，其他2組制備成哮喘模型。動物模型制造：在第1、8天腹腔注射1 mL OVA (卵白蛋白)/AL(OH)3混合液 (含OVA 10 mg和AL(OH)3200 mg)致敏，第15天開始應用超聲霧化器于自制簡易霧化箱中以一定濃度的OVA生理鹽水溶液霧化激發，每次20 min，隔日1次，持續30d。激發濃度分別為前15 d的1%，后15 d的1.5%。空白組在第1、8天給予生理鹽水代替OVA/AL(0H)3混合液腹腔注射，第15天開始以生理鹽水代替OVA超聲霧化吸入， 每次20 min，隔日1次，持續30 d。

治療組給予三伏天隔姜灸聯合中藥敷貼 （白芥子、細辛、甘遂、延胡索等研末，治療前1天用姜汁及凡士林調成膏狀備用），穴位選擇大椎及雙側肺俞，置以直徑約0.8 cm、厚約0.3 cm的鮮生姜片，在姜片上放置底面直徑為0.6 cm的圓錐形艾柱 (約為1 g)艾灸，3壯后分別敷貼外敷藥4 h。于致敏后第15天 （初伏）霧化前0.5 h干預，隔日1次，連續30 d。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 腧穴ATP含量檢測

1.3.1.1 實驗樣品收集方法及標準溶液的制備 接好微透析注射泵和微透析管路，選用生理鹽水為灌流液，灌流速度為2 μL/min。使用麻醉劑為異氟烷的麻醉呼吸機，以5 cc/min×5的量將兔子麻醉誘導，定位大椎穴和肺俞穴，用留置針穿刺皮膚并將留置針的外套管留于皮膚內，借助外套管，將已用超純水浸泡過的線性探針的半透膜植入大椎穴和肺俞穴，將線性探針的入口端與微透析泵管路連接，出口端裝入EP管中，進行腧穴區透析液的收集，同時將麻醉量降至5 cc/min×2.5進行麻醉維持。前1 h的透析液不收集，1 h后，每20 min一管，共收集3管，標記后放-80℃冰箱保存。高效液相色譜測定時，取出解凍后再放入離心機中離心2 min，用移液槍吸取3管混合打入1個進樣瓶中進行測定。

精密稱取ATP、ADP、AMP、ADO標準品各10 mg，加10 mL生理鹽水配制成1mg/ml的混合標準液，然后加生理鹽水，配制成系列濃度的混合標準液，濃度從低到高依次為： 0.05、 0.1、 1、 10、 50、 100 μg/mL。 為減小誤差，進行平行試驗，每次不同濃度的混合標準液都配制兩管。

1.3.1.2 色譜條件 色譜柱： Waters ACQUITY UPLC C18色譜分析柱 (1.7 μm， 2.1×100 mm)

流動相：C相為甲醇，D相為50 mmol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的磷酸鹽緩沖液 (pH=6.8)，采用梯度洗脫，0～0.85 min時，流速為0.3 mL/min，5%的C相和95%的D相；0.85～0.86 min將流速降至0.1 mL/min；0.86～4.0 min時，維持0.1 mL/min流速，5%的C相和95%的D相；4.0～4.1 min，將流速升至0.3 mL/min，C相升至20%，D相降至80%；4.1～6.0 min時，維持0.3 mL/min流速，20%的C相和80%的D相；6.0～6.1 min，將流速維持0.3 mL/min，C相降至5%，D相升至95%；平衡至10 min結束。

柱溫為25℃，檢測波長259 nm，進樣量5 μL。

1.3.2 肺組織P2X7受體mRNA表達

1.3.2.1 總RNA的提取 取勻漿管，加入1 mL的Trizol Reagent，置冰上預冷；取100 mg肺組織，加入到勻漿管中；勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊；12000 rpm離心10 min取上清；加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min；4℃下12000 rpm離心10 min；將上清轉移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻；-20℃放置15 min；4℃下12000 rpm離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀；4℃下12000 rpm離心5 min；將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺上吹3 min；加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA；55℃孵育5 min；使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度：儀器空白調零后取2.5 μL待測RNA溶液于檢測基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測；將濃度過高的RNA進行適當比例的稀釋，使其終濃度為200 ng/μL。

1.3.2.2 實時熒光定量PCR反轉錄 取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液； 加入1 μL oligo(dT)18； 用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μL；于PCR儀上65℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻；依次加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制劑 （20 U/μL) 和1 μL RevertAi M-MuLV逆轉錄酶(200 u/μL)，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫60 min，結束后70℃保溫5 min滅活反轉錄酶。定量PCR：取0.2 mL PCR管，配制如下反應體系，每個反轉錄產物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5 μL， 7.5 μM基因引物2.0 μL， 反轉錄產物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL； PCR擴增， 預變性95℃10 min；循環 （40次）95℃，15 s→60℃，60 s；熔解曲線60℃→95℃，每15 s升溫0.3℃。

1.3.2.3 結果處理方法 △△CT法：每個標本重復3次，Ct值取平均值；△CT=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內標基因，待測樣本)；△△CT=△CT(待測樣本)-△CT(對照樣本)； 表達倍數=2-△△CT。

1.4 統計學方法 計量資料用 （）表示，采用SPSS 20.0統計分析，進行正態檢驗，符合正態分布，多組比較用單因素方差分析，2組組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布，采用獨立樣本秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大椎穴和肺俞穴ATP濃度檢測 表1。

表1 新西蘭兔大椎穴和肺俞穴ATP濃度 （，μg/mL）

表1 新西蘭兔大椎穴和肺俞穴ATP濃度 （，μg/mL）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組治療組只數6 6 6大椎穴ATP濃度 肺俞穴ATP濃度0.3950±0.0409 12.4150±1.2662 5.2417±0.9637 0.4650±0.0774 10.2986±0.9360△4.3400±0.9586#

2.2 肺組織P2X7受體mRNA表達 見表2。

表2 新西蘭兔肺組織P2X7受體mRNA的相對表達量 （）

表2 新西蘭兔肺組織P2X7受體mRNA的相對表達量 （）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

相對表達量0.1462±0.0785 3.3615±0.0254△1.1713±0.0153#組別空白組模型組治療組只數6 6 6

3 討論

哮喘是一種慢性氣道性炎性疾病，其發生與發展和氣道炎癥反應有著密切聯系。ATP是細胞不可缺少的能源物質，參與了細胞內各種代謝循環，同時它可由突觸釋放并作為突觸傳遞重要的神經遞質；還可由血小板、上皮細胞和嗜堿性粒細胞等釋放出來，通過自分泌到胞外與細胞表面的特異性受體結合，參與調節了多種細胞反應。研究表明[3-7]：ATP可對呼吸道產生多重影響，從而影響哮喘的發生及發展。ATP參與離子的跨膜轉運，促進呼吸道黏膜纖毛清除能力，維護肺部的宿主防御功能；作為一種重要的神經遞質或自分泌/旁分泌信使，不僅可促使呼吸道平滑肌的收縮，還可誘發呼吸道平滑肌上皮依賴性的舒張，顯示其復雜的雙重調節作用；是呼吸道疾病和炎癥發生的重要介導者，過量釋放將導致炎癥反應的加劇，對于哮喘的發生與發展起促進作用。本次實驗觀察到模型組腧穴區ATP的濃度顯著高于空白組，也表明ATP參與了支氣管哮喘的發生發展過程。

ATP的作用大多是通過激活細胞表面的特異性受體實現的，眾多受體中P2X7受體被認為是最特殊的受體。P2X7由595個氨基酸組成，是一種2次跨膜的蛋白，其N端和C端均在細胞內，在細胞膜上可形成3個或更多個同源亞基復合體。它與其他P2X受體的不同在于P2X7位于胞內的有239個氨基酸，顯著多于其他已知ATP受體亞型梭基端氨基酸數量 （27～129個），此結構基礎決定了P2X7功能的特異性。P2X7受體的持續激活將導致大的膜孔形成，使得相對分子質量為800×103的大分子都可以自由通過，最終導致細胞死亡，因此P2X7受體也被稱為P2Z受體，即細胞死亡受體[8]。大量實驗證明人類P2X7基因調節哮喘中氣道對感染的反應，P2X7基因所在的染色體基因位點包括許多和哮喘肺功能相關的基因。Denlinger等[9]研究表明，ATP的釋放是氣道炎癥反應細胞損傷過程中的一種有害信號，在人和小鼠過敏原激發后，氣道ATP水平升高，引發樹突狀細胞合成促進嗜酸粒細胞和淋巴細胞募集的細胞因子，導致氣道高反應性和氣道炎癥反應，而P2X7受體參與了ATP釋放的調控過程，阻斷P2X7可以減輕OVA激發的樹突狀細胞介導的嗜酸粒細胞和淋巴細胞浸潤。本次實驗觀察到模型組肺組織P2X7表達顯著高于空白組，表明P2X7受體參與了支氣管哮喘的發生發展過程。ATP可能是通過P2X7受體參與了支氣管哮喘的發生發展過程。

三伏灸是以 《內經·四氣調神大論》提到的 “圣人春夏養陽， 秋冬養陰， 以從其根”[10]為理論依據的一種治療方法，利用天陽、艾之辛陽之性以及藥物的溫陽、辛散、走竄作用通過穴位的特異性溫補脾腎、溫陽散寒，從而增強患者體質，減少支氣管哮喘的發作次數。近幾年，三伏灸在南方許多城市流行，在臨床上取得較為顯著的療效，得到了患者及其家人的普遍認可。本次實驗觀察到治療組腧穴區ATP的濃度和P2X7表達顯著低于模型組，表明：三伏灸可能通過下調局部穴位ATP的濃度，進而下調肺組織P2X7受體的表達量，從而改善炎癥反應達到臨床療效。

[1]文婧，蘇美玲，李淑娟，等.三伏灸不同灸量對支氣管哮喘新西蘭兔細支氣管形態的影響[J].中華中醫藥雜志，2017，32(11):4932-4935.

[2]陳銘，蘇美玲，文婧，等.三伏灸不同灸量對哮喘型新西蘭兔MMP-9表達的影響[J].中國中醫藥現代遠程教育，2017，15(17):143-145.

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