腦啡肽酶基因多態性與阿爾茨海默病及血管性癡呆的相關性研究

屈文英

阿爾茲海默病(Alzheimer’s Disease，AD)和血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是老年期癡呆最主要的兩種疾病，近年來，隨著人口老齡化的不斷進展，兩種疾病的患病人數呈現逐年增高的趨勢[1]。兩種疾病具體發病機制目前均尚不明確。就AD來說，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)瀑布理論是目前影響范圍最為廣泛的學說之一，該學說認為Aβ生成和清除失衡是神經元變性和癡呆發生的起始因素[2-3]。近年來，還有研究發現Aβ失衡可能與VD的發病和進展也密切相關[4]。腦啡肽酶(Neprilysin，NEP)是一種位于細胞表面的Ⅱ型膜蛋白，可參與腦內Aβ的降解[5]。有研究發現NEP與AD的發病和進展密切相關，但目前關于NEP基因多態性與AD相關性的研究較少，且觀點不一[6-8]，探討NEP及其基因多態性與VD之間聯系的研究更為罕見。因此，本研究通過比較AD患者、VD患者和正常老年人NEP基因多態性，為癡呆的防治提供理論依據，為臨床提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2013年1月-2016年6月于本科門診或(和)住院治療的AD、VD患者納入AD組和VD組。AD組和VD組患者均需經簡易精神狀態量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)及第4版美國精神醫學協會精神疾病診斷與統計手冊診斷為癡呆。AD組患者共138例，其中男56例，女82例，年齡64～81歲，平均年齡(75.4±8.5)歲，符合2011年美國神經病學、語言障礙和卒中老年性癡呆和相關疾病學會(NINCDS - ADRDA)很可能AD診斷標準，并排除由腦血管病、其他腦器質性或功能性精神神經疾病、嚴重全身性疾病引起的癡呆和假性癡呆，排除精神發育遲滯及老年人良性健忘癥。VD組患者共57例，其中男27例，女30例，年齡63～80歲，平均年齡(73.5±8.1)歲，其診斷及排除標準參見文獻[9]。參照AD組和VD組性別及年齡構成，從同期于本院體檢部體檢的無腦血管病病史且無認知功能障礙的健康老年人中隨機選擇150例作為對照組，其中男70例，女80例，年齡63～80歲，平均年齡(73.7±9.2)歲。所有入組人員均為漢族，彼此無血緣關系。本研究通過本院倫理委員會審核批準，所有入組人員均充分知情同意。

1.2 基因多態性檢測

采集清晨空腹時外周靜脈血5 mL，按照氯仿飽和酚法提取基因組DNA，以基因組DNA為模板，采用聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)聯合DNA直接測序法檢測NEP基因rs989692位點和rs6776185位點多態性。采用Primer5.0及Oligo6.0軟件設計引物并進行特性驗證，引物由上海生共生物有限公司合成，其中rs989692位點上游引物：5’-CTCTGTGCCCCAGTTTCCTAAT-3’，下游引物：5’-TATCTTGCTCCAGTGGCTTCCT-3’； rs6776185位點上游引物：5’-CACAGAGCATTAGCAGCAGTTCCT-3’，下游引物：5’-ACAGCCCTTCTCCTGCACATAT-3’。PCR反應體系(25 μL)包括10×Buffer 2.5μL，上、下游引物各1 μL，dNTP混合物2 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，模板DNA1 μL，剩余由滅菌蒸餾水補足，反應條件：95 ℃預變性4 min，然后按照95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s順序循環30周期，最后72 ℃延長3 min，經1%瓊脂糖凝膠電泳確定，對PCR產物直接測序。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件，計量資料均服從正態分布，計量資料以±s表示，2組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用Dunnett-t檢驗；計數資料以構成百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡定律檢驗。采用多因素Logistic回歸分析法評價各因素與缺血性腦卒中后繼發性癲癇的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組基本臨床特征比較

如表1，各組年齡、性別均無明顯差異(P均>0.05)；AD組和VD組比較，MMSE評分無明顯差異(P>0.05)；AD組和VD組MMSE評分與對照組比較均有明顯差異(P均<0.05)。

表1 各組基本臨床特征比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

如表2～3，各組NEP基因rs989692位點和rs6776185位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，其基因頻率已達到遺傳平衡，具有群體代表性。

表2 NEP基因rs989692位點基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

表3 Nrf2基因rs6776185位點基因型Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

2.3 基因型和等位基因分布頻率

如表4，各組NEP基因rs989692位點基因型和等位基因分布頻率均無明顯差異(P均>0.05)。對于rs6776185位點AD組和VD組分別與對照組比較，AA基因型和A等位基因分布頻率均明顯增多(P均<0.05)。AD組與VD組比較，2組基因型和等位基因分布頻率均無明顯差異(P均>0.05)。

3 討 論

有流行病學研究顯示年齡大于80歲老年人，約有20%患有癡呆。近年來，隨著生活和醫療水平的不斷發展，我國乃至全世界逐步進入老齡化社會，罹患癡呆的患者人數不斷增長[1]，AD和VD作為癡呆最主要的兩種疾病，探索其遺傳易感性，對癡呆的防治均有重要意義。Aβ對神經元和突觸具有毒性作用，可破壞突觸膜，導致神經細胞死亡，在局部形成“老年斑”，Aβ腦內沉積及“老年斑”形成是AD發病最重要的病理學特征之一。近年來不斷有研究發現Aβ在腦血管病及VD的發病中也起到重要作用[2-4,10]。NEP作為體內降解Aβ最重要的降解酶之一，近年來成為該領域研究的熱點。

NEP是一種含鋅離子的細胞表面Ⅱ型膜蛋白，屬于中性內肽酶M13家族中的一員，早在1995年Howell等[11]學者便發現NEP可能參與Aβ的降解；隨后Iwata等[12]學者通過向實驗大鼠海馬注射NEP選擇性抑制劑四氫噻吩證實了NEP對Aβ的降解作用。目前，越來越多的基礎研究和臨床試驗支持NEP與AD發病和進展密切相關，但NEP基因多態性與AD發病相關性的研究較少，且結論不一，缺乏大樣本的研究報道[6-8,13]。本研究在前期通過檢索中外相關文獻，發現NEP基因多態性位點存在多個，包括rs989692C/T、rs6776185A/G、rs3736187A/G、rs1836915T/C、-204G/C、159C/T等[13-15]，但目前研究結果發現可能與AD發病相關的位點不多，且少有研究取得重復驗證結果，甚至部分研究彼此矛盾，究其原因，筆者認為可能包括以下幾點：①各研究AD診斷標準不一致，目前關于AD診斷多采用NINCDS - ADRDA制定的很可能AD的診斷標準，該標準多以臨床癥狀為依據，本身特異性較差，容易導致選擇偏倚，且該標準不斷進行更新，采用不同版本的診斷標準，必然導致各研究在患者選擇上即存在較大差別；②缺少大樣本量研究報道。一方面樣本量不足可能導致研究檢驗效能降低，導致未出現陽性結果；另一方面不利于進一步按照危險因素進行分層，探討NEP基因多態性的作用；③AD是一種多基因共同作用的疾病，探討單一位點多態性對AD發病的影響，忽視了基因的相互作用，遺落了其他可能位點的功能；④可能不同種族使研究結果存在差異。NEP基因多態性與VD關聯性研究鮮有報道，多數研究通過證實NEP對Aβ具有降解作用，而Aβ參與VD發病，而間接推測NEP基因多態性與VD發病存在關聯[16-17]。

表4 NEP基因型和等位基因分布頻率

注：Ⅰ為AD組與VD組比較；Ⅱ為AD組與對照組比較；Ⅲ為VD組與對照組比較

rs989692C/T和rs6776185A/G是目前研究較多的2個位點，但同樣國內外報道的研究結果也不盡相同。本研究結果顯示3組患者rs989692位點基因型和等位基因分布頻率差異無統計學意義；對于rs6776185位點，AD組和VD組同對照組比較，AA基因型和A等位基因分布頻率均顯著增加，但(AA+AG)基因型差異無統計學意義，提示NEP基因rs6776185位點AA純合子基因型可能與AD及VD發病相關。本研究同時比較AD組和VD組患者rs6776185位點基因型和等位基因分布頻率，結果顯示差異無統計學意義，再次提示Aβ在兩種疾病發病中可能均扮演重要角色，NEP可通過降解Aβ干預AD、VD發病。

綜上所述，NEP基因rs6776185位點突變和AD及VD發病相關。然而，該研究也存在諸多不足之處，目前關于NEP基因多態性對AD、VD發作的確切作用機制和分子功能均未明確，需要進一步從研究方法、研究對象選擇等方面做出更為統一的標準，完善研究結果。另外，NEP基因多態性與其他基因以及其他作用因素相互作用的具體機制也仍需進一步研究。

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