解偶聯蛋白2基因-866G/A,Ala55Val及Ins/Del多態性與寧夏回族人群腦缺血發病風險的相關性研究

金毅然 馬斌武 孫文青 韓懷欽 何仲義 牛建國

目前腦缺血已成為臨床常見多基因疾病，其發病率、致殘率、病死率逐年提高。基因的單核苷酸多態性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學基礎。怎樣從數百萬SNP中找到確有臨床意義的功能性SNP，是個體化醫學所面臨的重大挑戰[1]。

功能性的SNP可能影響基因的表達水平及蛋白的活性，進而影響其在機體細胞內的功能[2]。解偶聯蛋白2(uncouple protein 2，UCP2)參與調控細胞內過氧化物質(ROS)的生成，其基因多態性(圖1)已經被眾多研究者在不同人群中證實[3]。寧夏地區的回族人群中，腦缺血發病率在逐年升高。目前尚無UCP2基因多態性在回族人群中的分布資料。本研究以寧夏地區回族人群為研究對象，分析UCP2基因多態性在回族人群的分布特點及UCP2SNP與腦缺血發病風險的相關性。

圖1 UCP2基因多態性分布位點示意圖

1 對象與方法

1.1 研究對象

回族腦缺血患者診斷及正常對照組：腦缺血組71例，來自2014年1月-2015年10月在寧夏醫科大學總醫院就診的寧夏地區回族住院患者，年齡50～65歲，均行顱腦CT和/或MRI檢查證實腦缺血，診斷依據中華醫學會神經病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南；對照組97例，為同期門診查體寧夏回族健康者，年齡50～65歲。所有研究對象均行生化項目檢查并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取 采集外周血，經抗凝后采用QIANGEN minikit按試劑盒說明書進行基因組DNA提取，利用Nanodrop ND1000測定DNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳判斷DNA質量，篩選優質DNA做后續實驗。

1.2.2 聚合酶鏈反應-限制性片斷長度多態性(PCR-RFLP)技術 采用Oligo7.0軟件設計引物。各位點引物序列為

UCP2-866G/A，上游引物 5’-CACGCTGCTTCTGCCAGG AC-3’；下游引物 5’-AGGCGTCAGGAGATGGACCG-3’。

Ala55Val(Exon4)，上游引物 5’-CTCCTCTTGGCTTAGATTCCTG-3’；下游引物 5’-GACAGAATCATACAGGCCGAT-3’。

Ins/Del(Exon8)，上游引物 5’-TGCCCTCCTTTCTCCGCTTG-3’；下游引物 5’-ATGGACCAGATGACCTACACG-3’。

采用常規PCR擴增包含相應位點的DNA片段。經凝膠電鑒定擴增產物后經限制性內切酶消化，37 ℃ 4 h，將酶切產物電泳后采用Bio-Rad凝膠成像系統判斷基因分型。

1.2.3 統計學處理

采用SPSS19.0分析軟件，檢驗水準設定為雙側P<0.05。定量數據均以均數±標準差(±s)表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，變異位點的基因型和等位基因頻率的組間差異分析采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組基本資料比較

正常對照組性別(男/女)比例為47/50，腦缺血組性別比例為37/34；正常對照組年齡(57.55±3.66)歲，腦缺血組年齡(58.68±3.86)歲；正常對照組體重(64.15±8.63)kg，腦缺血組體重(65.58±8.25)kg；2組在性別比例、年齡及體重等基礎數據方面無明顯差異(P>0.05)。腦缺血組血清甘油三酯含量(1.62±0.58) mmol/L高于正常對照組(1.62±0.58) mmol/L(P<0.05)，但2組血清總膽固醇水平無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 腦缺血組及正常對照組基本資料比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05

2.2 UCP2-866G/A在寧夏地區回族正常人群、腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關性

在回族正常人群中UCP2-866位點基因型GG、AA、GA的分布頻率分別為23.71%，24.74%，51.55%；在腦缺血患者中分布頻率分別為30.98%，21.13%，47.89%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表2)。

表2 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2-866位點等位基因G、A的分布頻率分別為49.48%，50.52%；在腦缺血患者中分布頻率分別為54.93%，45.07%。2組等位基因型G、A的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表3)。

表3 回族正常人群及腦缺血患者UCP2-866G/A等位基因分布特點[n(%)]

2.3 UCP2Ala55Val在寧夏地區回族正常人群及腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關性

在回族正常人群中UCP2Ala55Val基因型Ala/Ala、Ala/Val、Val/Val的分布頻率分別為31.96%，49.48%，18.56%；在腦缺血患者中分布頻率分別為32.39%，46.48%，21.13%。2組分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表4)。

表4 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ala55Val等位基因C、T的分布頻率分別為56.70%，43.30%；在腦缺血患者中分布頻率分別為55.63%，44.37%。2組等位基因型C、T的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表5)。

表5 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ala55Val等位基因分布特點[n(%)]

2.4 UCP2Ins/Del在寧夏地區回族正常人群及腦缺血患者分布特點及其與回族人群腦缺血的相關性

在回族正常人群中UCP2Ins/Del位點基因型Del/Del、Ins/Del、Ins/Ins的分布頻率分別為49.5%，41.2%，9.3%；在腦缺血患者中分布頻率分別為47.9%，42.3%，9.8%。2組頻率分布無明顯差異(P>0.05)(表6)。

表6 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del基因型分布特點[n(%)]

在回族正常人群中UCP2Ins/Del等位基因Ins、Del的分布頻率分別為70.10%，29.90%；在腦缺血患者中分布頻率分別為69.01%，30.99%。2組等位基因型Ins、Del的分布頻率無明顯差異(P>0.05)(表7)。

表7 回族正常人群及腦缺血患者UCP2Ins/Del等位基因分布特點[n(%)]

3 討 論

研究者們對于基因的各種功能以及基因與疾病的發生和治療的關系等仍在進一步的探索中。人類的基因組序列存在個體差異，包括對疾病的易感性、對同一疾病治療藥物的反應性等。基因的單核苷酸多態性(SNPs)是形成個體間差異的重要遺傳學基礎，基于SNP分析的個體化醫療特點已經基本確立[4]。

UCP2是線粒體陰離子轉運體蛋白家族中的一員，它存在于線粒體內膜上。研究證明，UCP2參與調控細胞內過氧化物質(ROS)的生成[5]。Negre-Salvayre等用GDP抑制多種組織線粒體中UCP2的質子轉運活性，結果發現AMP 增高，線粒體內ROS的產生也明顯增加[6]。基因敲除的小鼠胰島細胞中的活性氧水平明顯升高[7]。腦缺血后細胞內ROS產生增多或清除能力減弱導致神經細胞對缺血的易感性升高，將對機體產生嚴重損害。研究者證實，UCP2通過參與神經元線粒體氧化磷酸化過程來降低神經元ROS水平[3]。本課題組在以往研究中發現,腦缺血后小鼠海馬神經元DNA過氧化損傷與UCP2基因表達水平相關[8]。

功能性的SNP可能影響基因的表達水平及蛋白的活性，進而影響其在機體細胞內的功能[9]。UCP2 基因的多態性已經被眾多研究者在不同人群中證實。國內學者曾經分析了UCP2 基因的多態性在北京地區人群的分布特點[10]。UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del被證明在一些特定人群與糖尿病的發病風險密切相關[11]。以上3個位點的多態性直接影響UCP2基因表達水平及蛋白功能，影響細胞的能量代謝。雖然腦缺血的發病亦與機體細胞能量代謝水平紊亂相關，但是本研究結果表明UCP2-866G/A，UCP2 Ala55Val和UCP2 Ins/Del多態性與寧夏地區回族人群腦缺血發病無明顯相關性。

本研究首次以寧夏地區回族人群為研究對象，分析了UCP2 基因多態性在回族人群的分布特點及UCP2 SNP與腦缺血發病風險的相關性，為我區臨床防治回族人群腦缺血提供遺傳學資料。

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