沉默Cdk5對星形膠質細胞活化增殖和細胞周期的影響

龍根 蘇竹毅 謝敏杰 王偉 徐沙貝 劉晨辰

細胞周期是細胞生命活動的重要特征和基本過程，其運行主要通過細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinases，Cdks)的蛋白激酶家族進行調節[1]。其中，細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)作為Cdks家族的一員，是一種脯氨酸介導的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其氨基酸序列與Cdk2和細胞分裂周期激酶2(cdc2)有60%的同源性[2-3]。然而相比于其他細胞周期依賴性激酶，在中樞神經系統高度表達的Cdk5并不直接參與細胞周期，并且需要與非細胞周期調節亞基蛋白 p35和p39以及它們的截短形式p25和p29結合才能產生活性[4]。Cdk5在中樞神經系統正常生長發育調節神經細胞遷移、軸突生長、神經遞質釋放、突觸可塑性及認知功能等方面發揮重要作用[5-7]，然而Cdk5在星形膠質細胞增殖過程中的作用尚不明確。本研究采用RNA干擾技術特異性沉默Cdk5，觀察其對星形膠質細胞增殖的影響，探討Cdk5在星形膠質細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新生24 h內的SPF級SD大鼠乳鼠，購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。DMEM/F12、胎牛血清(美國Hyclone公司)，Opti-MEM(美國Gibco公司)，小鼠抗大鼠GFAP抗體(美國Neomarkers公司)，兔抗大鼠Cdk5抗體(美國Santa Cruz公司)，FITC標記羊抗兔IgG、Cy3標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗小鼠IgG、HRP標記羊抗兔IgG(美國Jackson ImmunoResearch公司)，Edu試劑盒(上海銳博公司)，Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，Cdk5引物及內參(上海生工生物工程股份有限公司)。設計3種作用于星形膠質細胞Cdk5的干擾序列為目的的siRNA分別為Si-r-Cdk5-001、Si-r-Cdk5-002及Si-r-Cdk5-003(表1)，由廣州銳博生物有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質細胞原代培養和純化鑒定

取新生24 h內的SD大鼠乳鼠腦組織，PBS漂洗3遍，冰上小心去除腦膜及血管，取皮層組織置于無血清的DMEM/F12培養基中，眼科剪剪碎，0.125%胰酶37℃消化2 min，用含15%胎牛血清DMEM/F12培養基中和胰酶，用200目篩網過濾，4℃ 800 r/min離心5 min，棄上清液，用含20%胎牛血清DMEM/F12培養基重懸，種于用多聚賴氨酸包被的培養瓶中，放置于恒溫培養箱中，24 h后換液，除去死亡細胞和未貼壁細胞，之后2～3 d換液，傳代2次后可用于實驗。

將星形膠質細胞爬片，冰甲醇固定15 min，PBS漂洗3次，0.2% Triton X-100破膜15 min，PBS漂洗3次，5% BSA封閉1 h，PBS漂洗3次，小鼠抗大鼠GFAP抗體(1∶200)4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，FITC標記羊抗小鼠IgG抗體(1∶200)避光室溫下孵育1 h，PBS漂洗3次，DAPI染核8 min，PBS漂洗3次，50%甘油封片，熒光顯微鏡進行觀察。

1.2.2 siRNA轉染

將星形膠質細胞用0.25%胰酶消化，含15%胎牛血清DMEM/F12培養基中和胰酶，4℃ 800 r/min離心5 min，不含血清Opti-MEM培養基重懸細胞，置于離心管中備用。用不含血清的Opti-MEM培養基稀釋Lipofectamin 2000和siRNA，室溫置于EP管中5 min，將稀釋后的Lipofectamin 2000和siRNA輕柔混勻，室溫靜置20 min形成siRNA/Lipo 2000復合物，將復合物加入備好的含有星形膠質細胞的離心管中，輕柔搖勻后靜置5 min，將細胞種入細胞培養板中，將細胞培養板置于36℃細胞培養箱中培養6 h后改成含15%胎牛血清DMEM/F12培養基繼續培養，利用轉染Cy3-siRNA的細胞來觀察轉染效率。根據實驗需要，有3組siRNA序列可篩選，即Si-r-Cdk5-001(SiT1)組、Si-r-Cdk5-002(SiT2)組及Si-r-Cdk5-003(SiT3)組，分別加入SiT1/Lipo 2000復合物、SiT2/Lipo 2000復合物及SiT3/Lipo 2000復合物;同時設置空白對照組和陰性對照組，其中陰性對照組加入陰性對照siRNA，陰性對照siRNA與目的siRNA序列有相同的堿基組分，但排列不同;與Cdk5無同源性的序列用來排除轉入siRNA本身對細胞的影響。

1.2.3 RT-PCR

通過訪談和實驗，認為語速緩慢，語音較高適合老年人的學習。但是這部分的課程只能是針對老年人開設的。如同上文所說，不能讓受眾面擴大。

細胞總RNA提取按照Trizol說明書進行，將溶解后的RNA取1 μL用DEPC水稀釋200倍后用紫外分光光度計測定OD260、OD280及OD260/OD280比值，計算RNA的純度及水平。將RNA在65℃條件下預變性5 min，42℃條件下60 min逆轉錄60 min，70℃條件下終止反應5 min，合成cDNA。PCR擴增引物序列為Cdk5，上游引物：5’-GGCACCTACGGAACTGTGTT-3’，下游引物：5’-CACAATCTCAGGGTCCAGGT-3’；GAPDH，上游引物：5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’，下游引物：5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。PCR擴增條件為95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 5s，30個循環。最終數據以2-△△Ct法進行分析。

表1 大鼠Cdk5 siRNA序列

1.2.4 Western Blot檢測

收集轉染72 h后的星形膠質細胞，加裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測蛋白水平。取20 μg蛋白進行10% SDS-PAGE電泳，250 mA、90 min轉至PVDF膜，PVDF膜經5%脫脂牛奶封閉液封閉90 min后小鼠抗大鼠Cdk5抗體(1∶500)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，HRP標記羊抗小鼠IgG抗體(1∶8000)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL液顯色曝光，采用Gene Genius Bio-Imaging system凝膠成像分析系統對電泳進行采集和拍照，將拍照用軟件ImageJ對條帶的灰度信號(OD值)加以半定量分析。

1.2.5 Edu檢測細胞增殖

取已轉染Cdk5 siRNA的星形膠質細胞及對照組細胞分別接種于24孔板，各個檢測時間點前2 h加入Edu，2 h后取出細胞，PBS漂洗3次，室溫下用冰甲醇固定細胞15 min，然后按照Edu試劑盒說明書進行染色。

1.2.6 流式細胞術分析細胞周期

取已轉染Cdk5 siRNA的星形膠質細胞及對照組細胞置于0.1 mL PBS中，加入1 mL 80%的冰乙醇后放入-20℃，檢測前用PBS漂洗冰乙醇2次，用終濃度為50 μL/mL的PI染液4℃避光染色過夜，用流式細胞儀檢測星形膠質細胞細胞周期變化。

1.2.7 統計學處理

2 結 果

2.1 星形膠質細胞培養及鑒定

SD大鼠乳鼠星形膠質細胞原代培養得到純化的星形膠質細胞，呈不規則形，邊界清晰，胞體豐滿扁平，細胞間彼此連接，折光性強，將星形膠質細胞行GFAP免疫熒光染色，證明原代培養的星形膠質細胞98%表達膠質纖維酸性蛋白GFAP(圖1)。

圖1 大鼠星形膠質細胞的鑒定 其中綠色為GFAP陽性,藍色為細胞核DAPI染色

2.2 Cdk5-siRNA轉染效率及沉默效率

星形膠質細胞轉染Cy3-siRNA，培養后熒光染色可見Cy3標記的siRNA包繞在細胞核周圍，提示成功轉染入星形膠質細胞，轉染效率可達85%以上。利用RT-PCR和Western blot分別測定Cdk5 mRNA及蛋白表達水平來篩選最有效沉默星形膠質細胞Cdk5的siRNA。其中RT-PCR顯示與空白對照組比較， SiT1組、SiT2組及SiT3組的Cdk5 mRNA表達水平都降低(P<0.01)，其中SiT3轉染后的Cdk5 mRNA表達水平最低(圖2)。Western blot顯示與空白對照組比較，SiT1、SiT2及SiT3轉染后的Cdk5蛋白水平均降低(P<0.01)，其中SiT3組的Cdk5 蛋白表達水平最低(圖2)，這與RT-PCR一致。因此，后續實驗選取SiT3作為Cdk5 siRNA對星形膠質細胞進行干預。

圖2 不同Cdk5-siRNA對Cdk5表達水平的影響 其中A為RT-PCR,SiT3組的Cdk5mRNA表達水平最低,與陰性對照組比較,*P<0.01;B為Westernblot,SiT3組的Cdk5蛋白表達水平最低,與陰性對照組比較,*P<0.01

2.3 Edu檢測星形膠質細胞增殖

Edu陽性反應位于胞核內，Edu檢測顯示Cdk5 siRNA干預組3、6、12 h Edu染色陽性率較對照組顯著降低(P<0.01)，24 h Cdk5 siRNA干預組與對照組的比較無明顯差異(P>0.05)(圖3)。

2.4 流式細胞術檢測星形膠質細胞細胞周期變化

流式細胞術對星形膠質細胞細胞周期分析顯示Cdk5 siRNA干預組3、6、12 h處于S期的星形膠質細胞比例較對照組顯著降低(P<0.05)，24 h 2組S期細胞比例無明顯差異(P>0.05)(圖4)。

3 討 論

細胞周期在真核細胞的生長、分化及增殖過程中起到決定性作用。通常細胞在細胞周期相關蛋白的精密調控下可以完美地完成整個細胞周期過程，然而一旦出現任何異常調節的情況均可導致細胞功能的異常，甚至細胞死亡。神經元和膠質細胞作為中樞神經系統中最主要的兩類細胞，以往普遍認為成熟的神經元屬于終末分化細胞，不具備增殖能力，但最新研究顯示神經元受到損傷時可出現細胞周期的重激活，神經元可重新進入細胞周期，但是細胞周期激活后的神經元并不能完成整個細胞周期，最終會走向死亡[8-9]。相反，膠質細胞不同于神經元，它本身即具備增殖的能力，受損的膠質細胞可發生過度激活，從而致使膠質疤痕的形成以及炎性因子大量釋放[10]。

星形膠質細胞作為中樞神經系統中最多的細胞，在正常狀態下可以維持內環境穩定、清除氧自由基、減輕神經興奮性毒性、介導血管形成、營養神經再生等。在神經系統受損后(包括缺血、損傷等)星形膠質細胞出現細胞肥大、活化增殖等現象。活化的星形膠質細胞雖然在一定程度上能夠保護周圍受損的神經元，但過度的活化增殖可直接介導神經元的死亡以及膠質疤痕的形成，從而造成更進一步的損傷[11]。雖然損傷后星形膠質細胞活化增殖的具體機制目前仍不清楚，但前期研究已經發現細胞受損后細胞周期重激活及細胞周期的調控在其中起到關鍵性作用[12-13]。

圖3 Edu染色觀察Cdk5siRNA干預對星形膠質細胞增殖的影響 其中A為干預12h2組星形膠質細胞的Edu染色;B為干預后不同時間點星形膠質細胞Edu染色陽性細胞率,與對照組比較,*P<0.01

圖4 流式細胞術分析Cdk5siRNA干預對星形膠質細胞細胞周期的影響 其中A為干預12h2組星形膠質細胞的流式細胞術檢測;B為干預后不同時間點星形膠質細胞處于S期細胞比例,與對照組比較,#P<0.05

參與細胞周期調控過程主要包括細胞周期蛋白(Cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶 (Cyclin dependent kinases,Cdks)和Cdks抑制蛋白(Cyclin dependent kinases inhibitors，CdkIs)[12]。其中Cdks發揮重要作用。細胞周期蛋白依賴性激酶5(Cyclin-dependent kinases 5，Cdk5)是Cdks家族中的一員。Cdk5被認為是“標新立異”的Cdks成員，它并不直接參與細胞周期調控，它可以和CyclinD1和D2結合，但并不產生激酶活性，與調節因子p35或p39結合后產生活性[4]。其中p35主要在大腦皮質中起作用，而p39更多出現在小腦[14]。通常來講，Cdk5的活性在活體內被有序的調控，包括p35和Cdk5基因的轉錄控制、p35的降解、p35和Cdk5的磷酸化和結合以及p35到p25的轉變等[15]。

早期研究證明CDK5在神經元中存在表達，且在神經元的正常生理功能中起關鍵作用。有研究顯示CDK5/p35復合體穩定可以維持神經元的存活，但同時也證實在多種中樞神經系統疾病中CDK5的過度激活可以介導一系列反應，最終導致神經元的死亡[16-18]。此外，Zhang 等[17,19]發現在神經系統受損后神經元細胞周期重激活導致神經元死亡和CDK5胞漿胞核的表達變化密切相關。由此可見CDK5在神經元各個過程中均起到重要作用。然而在星形膠質細胞中關于Cdk5的研究很少。

目前Cdk5抑制劑(例如roscovitine，olomoucine或者butyrolactone-1)被頻繁使用，但最主要的問題是這些抑制劑對其他Cdks也都有抑制作用[20-22]。因此，特異性沉默星形膠質細胞Cdk5顯得尤為重要。RNA干擾是近年來發展的新技術，利用小的雙鏈RNA特異性降解與其同源的mRNA來阻斷體內特定基因表達[23]。本研究利用RNA干擾技術特異性沉默星形膠質細胞Cdk5后Edu檢測結果顯示RNA干擾沉默Cdk5組Edu染色陽性率較對照組降低，流式細胞術檢測結果與Edu檢測結果一致，RNA干擾沉默Cdk5組的S期細胞率較對照組減少。將Edu染色及流式細胞術檢測結合起來能更加準確反映DNA合成的S期。本研究結果顯示特異性沉默Cdk5可顯著降低星形膠質細胞的增殖及細胞周期進展，可以推測Cdk5對星形膠質細胞的增殖可能起正向調控作用，但具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示沉默Cdk5可抑制星形膠質細胞的增殖及細胞周期進展，通過對Cdk5的干預可能起到抑制星形膠質細胞過度活化增殖的目的，可為進一步研究中樞神經系統損傷后反應性星形膠質細胞過度活化增殖機制和調控提供實驗依據。

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