白藜蘆醇對過氧化氫誘導人視網膜色素上皮細胞凋亡的保護作用

楊影 吳崢崢 程依璉 林偉 曲超

四川省醫學科學院·四川省人民醫院眼科（成都610072）

年齡相關性黃斑變性（age?related macular de?generation，AMD）是50歲以上人群中視力損傷的主要原因之一。越來越多的證據表明視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷與AMD的發生有密切的聯系［1?4］。目前藥物治療AMD的研究主要為抗氧化劑的研究如葉黃素、維生素E和胡蘿卜素等和活血化瘀類中成藥，但效果不確切，因此研究一種預防和治療AMD的藥物勢在必行。白藜蘆醇是一類主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄、花生等植物中的非黃酮類多酚化合物，屬于植物在抵抗外界刺激而產生的一種植物保護素［5?6］，藥理學研究表明它具有強大的抗氧化、清除氧自由基以及抗凋亡的能力［7］，但有關白藜蘆醇對視網膜色素上皮細胞是否具有抗氧化及抗凋亡活性以及它的作用機制，至今未見報道。本研究采用H2O2對人RPE細胞進行氧化損傷，給予白藜蘆醇預處理，研究白藜蘆醇對人RPE細胞凋亡有無抑制作用，并探討可能的作用機制，從而為老年性黃斑變性的防治尋找新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器 白藜蘆醇和H2O2溶液（購自美國 Sigma Aldrich公司），RPMI?1640培養基、胎牛血清（購自美國GIBCO公司）、CCK?8試劑盒（購自美國Sigma公司），超凈工作臺（購自蘇州凈化設備有限公司），細胞培養箱（購自美國Shellab公司），Annexin?V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；碘化丙啶購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞復蘇與培養 遵守快融的原則，將細胞凍存管從液氮罐中取出，置于55～65℃水浴中迅速解凍，取出細胞懸液，注入離心管并加入5 mL的含10%胎牛血清（FBS）的細胞培養液。以800～1 000 r/min離心5 min，除去上清液，加入1 mL培養液吹打，使其形成懸浮液。用含20%FBS的細胞培養液適當稀釋后，調整細胞濃度為50×106mL接種到25 cm2培養瓶，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養，每2天換液1次，細胞近鋪滿（80%～90%）時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取對數生長期的人RPE傳代細胞接種于6孔板及96孔板中。

1.2.2 實驗分組 選取生長良好的第3～5代人RPE傳代細胞采用無血清的DMEM培養液培養24 h，同步化后分成3組：第一組為正常對照組，每組3孔，用6 mL DMEM培養液培養細胞；第二組為氧化損傷組，用DMEM培養液培養24 h后將200 μmol/L H2O2加入RPE細胞培養液中制備RPE細胞氧化損傷模型。第三組為白藜蘆醇保護組，將50 mg/L白藜蘆醇加入RPE細胞培養液中，24 h后加入 200 μmol/L H2O2，將細胞置于 5%CO2培養箱內分別培養2、8、24 h。

1.2.3 CCK?8法檢測細胞活性 取其第3代，0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104個/mL，按每孔0.2 mL接種于96孔培養板，37℃、5%的CO2培養箱中培養24 h，無血清培養液洗滌3次，按上述分組方案進行分組加藥，將細胞置于5%CO2培養箱內分別培養2、8、24 h后，棄去接種液，加入CCK?8 10 μL，37℃、5%的CO2培養箱中培養4 h后棄液，加入DMSO 100 μL，振蕩10～15 min，用酶標儀測光密度A值。計算不同濃度藥物作用后對細胞的抑制率。細胞增生抑制率（HA）=（對照組A值?實驗組A值）/對照組A值×100%。

1.2.4 細胞周期的檢測 收集生長良好的人RPE細胞，調整細胞濃度至1×106mL，分別接種于6孔板中培養24 h，按照實驗分組處理細胞后，將細胞置于5%CO2培養箱內分別培養2、8、24 h，加入冰浴預冷70%乙醇中固定過夜。棄去乙醇，PBS清洗2次，加入0.5 mL碘化丙啶染色液，37℃避光溫浴30 min。采用流式細胞儀檢測樣品，采用Multicycle分析軟件進行細胞DNA含量分析和光散射分析。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取對數生長期的人RPE傳代細胞接種于6孔板培養細胞，5%CO2培養箱孵育24 h后，按照實驗分組處理細胞后，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞，取5萬～10萬重懸的細胞，1 000g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V?FITC結合液輕輕重懸細胞。室溫（20～25℃）避光孵育10 min。1 000g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V?FITC 結合液輕輕重懸細胞。加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，計量資料以±s表示，組間均數比較采用單因素方差分析和Turkey′s多因素t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對人RPE細胞抑制率的影響 通過CCK?8法檢測發現，50 mg/L白藜蘆醇保護組作用2、8、24 h細胞抑制率分別為 17.01%、19.97%、24.58%，明顯降低了細胞抑制率，且與氧化損傷組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 白藜蘆醇對人RPE細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，氧化損傷組細胞凋亡率顯著增高（P＜0.01），經白藜蘆醇保護作用2、8、24 h后，與氧化損傷組相比細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 白藜蘆醇對人RPE細胞凋亡的影響Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

表1 白藜蘆醇對人RPE細胞凋亡的影響Tab.1 The effect of resveratrol on apoptosis of human RPE cells ±s，%

注：白藜蘆醇保護組和氧化損傷組比較，★P＜0.01；氧化損傷組和對照組比較，△P＜0.01

2 h 8 h 24 h組別正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組凋亡率7.45±0.41 14.24±0.29△9.29±0.03★6.99±0.07 19.28±0.15△10.12±0.09★7.47±0.09 25.60±1.06△18.22±0.69★

2.3 白藜蘆醇對人RPE細胞周期的影響 流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，氧化損傷組G0/G1期、G2/M期細胞比例顯著增加，S期細胞比例顯著減少（P＜0.01）；經白藜蘆醇保護作用2、8、24 h后，處于G0/G1期細胞比例和氧化損傷組相比明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；處于S期細胞比例和氧化損傷組相比明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。圖1、表2。

圖1 白藜蘆醇作用人RPE細胞2、8、24 h后對細胞周期的影響Fig.1 The effect of RPE cells on the cycle of human RPE cells at 2、8、24 h

表2 白藜蘆醇對人RPE細胞周期的影響Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

表2 白藜蘆醇對人RPE細胞周期的影響Tab.2 The effect of resveratrol on cycle of human RPE cells ±s，%

注：白藜蘆醇保護組和氧化損傷組比較，*P＜0.01；氧化損傷組和對照組比較，△P＜0.01

G2/M 3.2±0.09 18.21±0.13△42.14±0.65*2.04±0.72 32.75±0.79△17.21±0.46*7.58±0.07 51.10±0.47△40.54±0.24*組別正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組正常對照組氧化損傷組白藜蘆醇保護組G0/G1 40.22±0.20 55.13±0.08△14.67±0.88*44.91±0.37 48.21±0.45△40.85±0.25*44.23±0.10 47.18±0.35△25.75±0.31*S 2 h 8 h 24 h 56.57±0.12 26.64± 0.22△43.02±0.40*53.05±0.34 19.03± 0.38△41.94±0.23*48.18±0.02 18.70± 0.18△33.71±0.10*

3 討論

AMD的病因學和發病機制至今未明，目前多數研究認為與老化、氧化損傷、炎癥免疫、血管生成及抑制因子失調等因素有關［8］，隨著年齡增長，人體抗氧化能力逐漸減弱，RPE細胞位于脈絡膜毛細血管層和光感受器細胞層之間，導致其特別容易受到氧自由基的攻擊，從而引起AMD等視網膜疾病的發生［9］，已有研究證實，RPE細胞的氧化損傷在AMD的早期即可出現［10?11］。氧化損傷往往伴隨凋亡的發生［12］，研究發現［13］，RPE氧化損傷的主要靶細胞器是線粒體，其損傷水平取決于活性氧的量。活性氧的釋放可以通過誘導REP細胞的凋亡，參與視網膜色素上皮屏障功能的損傷。體外實驗也證實［14］，氧化應激可以誘導REP細胞發生凋亡，這可能是AMD早期RPE細胞死亡的一個途徑。H2O2是一種極易透過細胞膜的強氧化劑，通過增加細胞內活性氧含量發揮對細胞的氧化損傷作用［15?17］。自從20世紀 40 年代以來，白藜蘆醇一直頗受醫學界的重視，尤其是其抗氧化與自由基能力尤為突出，體外實驗發現白藜蘆醇能清除多種活性氧簇［18］，但未見報道對RPE細胞保護作用的研究，本實驗以活性氧形式之一的H2O2作用于視網膜色素上皮細胞，造成RPE氧化損傷，研究白藜蘆醇對RPE凋亡的保護作用。

本研究結果發現H2O2氧化損傷組2、8、24 h細胞抑制率為26.77%、37.81%、66.12%，白藜蘆醇保護組作用2、8、24 h細胞抑制率分別為17.01%、19.97%、24.58%，與氧化損傷組相比明顯降低了細胞抑制率，且與時間呈依賴性，表明白藜蘆醇對體外培養的人RPE細胞氧化損傷有一定的保護作用，能顯著降低細胞抑制率。

研究發現，H2O2可導致RPE細胞大量凋亡，而預先加入陽性對照藥白藜蘆醇培養，可明顯抑制RPE細胞凋亡，白藜蘆醇保護作用2、8、24 h后，與氧化損傷組相比細胞凋亡率明顯降低，說明白藜蘆醇保護氧化損傷的RPE細胞，降低細胞抑制率是通過抑制RPE細胞凋亡途徑實現。

當細胞的生長被阻滯在某個階段，細胞就會對損傷的DNA進行修復，如果修復失敗，則會發生凋亡，細胞的增殖必然受影響。本實驗結果表明白藜蘆醇作用于RPE細胞后，處于G0/G1期細胞比例和氧化損傷組相比明顯降低，處于S期細胞比例明顯升高，表明白藜蘆醇在一定程度上可以促進氧化損傷的視網膜色素上皮細胞細胞周期進展，由G0/G1期進入S期，推測白藜蘆醇抑制RPE細胞凋亡可能是通過調控細胞周期，誘導細胞由G0/G1期進入S期。

綜上所述，白藜蘆醇對體外培養的人RPE細胞氧化損傷有一定的保護作用，其機制可能是通過調控細胞周期，誘導細胞由G0/G1期進入S期，從而抑制RPE細胞凋亡，提示白藜蘆醇對AMD的預防和治療有一定的作用。鑒于體外培養的RPE細胞與活體內的RPE有一定差別，對各種損傷的反應也可能會有所不同，所以白藜蘆醇對于RPE的保護作用及其在臨床上的治療效果和具體應用還有待進一步研究。

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