糖尿病心肌病患者內(nèi)源性抗氧化體系及氧化應(yīng)激水平

齊曉丹 常凌峰 于海濤 劉穎 高勇 林樹東 閆曉光 許冬霞 張春晶

1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院（161006黑龍江齊齊哈爾）；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院（161006黑龍江齊齊哈爾）；3齊齊哈爾市第一醫(yī)院（161006黑龍江齊齊哈爾）

糖尿病患者長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心肌功能降低，而引起糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）［1-2］，DCM發(fā)病率高，危害大，日益受到研究者的廣泛關(guān)注［3］。DCM發(fā)病機(jī)制涉及糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、心臟自主神經(jīng)病變、心肌細(xì)胞凋亡等，其中心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)是DCM較早期的分子事件［4］。

糖尿病狀態(tài)下氧化還原狀態(tài)失衡，也會(huì)引起血液中一系列內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的改變，其中內(nèi)源性抗氧化肽肌肽和谷胱甘肽系統(tǒng)是心肌細(xì)胞氧化還原體系的重要組成成分［5］，其會(huì)如何變化及程度如何未見報(bào)道。本研究探討DCM患者血清中內(nèi)源性肌肽、谷胱甘肽系統(tǒng)及氧化應(yīng)激的水平，分析DCM患者內(nèi)源性抗氧化體系——肌肽、谷胱甘肽系統(tǒng)與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。闡明內(nèi)源性抗氧化體系對(duì)糖尿病心肌病變保護(hù)作用的分子生物學(xué)機(jī)制，以期為DCM的防治提供一個(gè)新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年6月至2016年9月齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院體檢健康者（對(duì)照組）102例，男50例，女52例；2型糖尿病患者（DM組）96例，男49例，女47例；確診DCM患者（DCM組）74例，男38例，女36例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)制定的DCM和T2DM 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；（2）患者知情同意并簽署知情同意書。所有患者均行空腹血糖（FPG）、餐后2 h血葡萄糖（2hPG）、血清總膽固醇（TC）、血清三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、胰島素（FINs）、C肽、糖化血紅蛋白（HbA1c）［7］等檢測(cè)。

1.2 方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清人肌肽含量，微量酶標(biāo)法測(cè)定總谷胱甘肽（T?GSH）、還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）水平，比色法測(cè)定GSH過氧化物酶（GSH?Px）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活性及谷胱甘肽還原酶活性系數(shù)（GRAC），硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮（NO）含量，鉬酸顯色法測(cè)定過氧化氫（H2O2）含量，比色法測(cè)定一氧化氮合成酶（NOS）和過氧化氫酶（CAT）活性，試劑盒購自南京建成生物有限公司。結(jié)果以美國BioTek Elx800多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（A值）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)處理組間比較用F檢驗(yàn)，兩兩比較用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 各組之間資料進(jìn)行比較分析，與對(duì)照組相比較，DM組、DCM組的例數(shù)、性別、TC、TG、LDL、HDL指標(biāo)比較，差異無顯著性（P＞0.05）。與對(duì)照組相比較，DM組、DCM組的BMI、FPG、2hPG、FINs、C肽、HbA1c等指標(biāo)明顯升高（P＜0.05），見表 1。

2.2 各組血清肌肽含量的變化 對(duì)照組血清肌肽平均值正常，DM組、DCM組平均值均低于正常。DM組與對(duì)照組相比有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。DCM組與對(duì)照組相比降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DCM組與DM組相比較無顯著變化（P＞0.05）。結(jié)果顯示，DM和DCM時(shí)患者機(jī)體氧化應(yīng)激增強(qiáng)，抗氧化肽消耗增加，血清中的抗氧化肽肌肽含量降低。見圖1。

表1 各組一般資料對(duì)比分析Tab.1 Comparison analysis of clinical data among the groups x±s

圖1 ELISA法檢測(cè)人血清肌肽含量Fig.1 To detect human serum carnosine by ELISA method

2.3 各組血清谷胱甘肽系統(tǒng)水平測(cè)定 見表2。 結(jié)果顯示，DM和DCM時(shí)機(jī)體谷胱甘肽系統(tǒng)異常，還原型GSH降低，氧化型GSSG升高，GSH/GSSG比值降低，GRAC及GST等活性降低，表明機(jī)體氧化水平增強(qiáng)，抗氧化能力減弱，氧化還原狀態(tài)失衡。

2.4 各組氧化還原水平分析 與對(duì)照組相比較，DCM組NO含量較對(duì)照組顯著升高（P＜0.01）；各組間TNOS活性差異無顯著性；iNOS活性和H2O2含量DCM組有所升高（P＜0.05）；DM組和DCM組CAT活性均顯著降低（P＜0.01），見圖2。結(jié)果表明，DM和DCM時(shí)體內(nèi)的氧化劑及自由基等增加，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。

表2 各組人血清谷胱甘肽系統(tǒng)水平分析Tab.2 Glutathione system level analysis in human serum among each group ±s

表2 各組人血清谷胱甘肽系統(tǒng)水平分析Tab.2 Glutathione system level analysis in human serum among each group ±s

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05，#P＜0.01

T-GSH（μmol/L）GSH（μmol/L）GSSG（μmol/L）GSH/GSSG比值GSH-PX活力（μmol/L）GRAC GST活力（U/mL）T-SH（μmol/L）對(duì)照組45.1±2.3 15.6±0.9 14.0±0.8 1.16±0.06 177.8±7.3 19.2±1.1 32.2±1.8 522.6±25.1 DM組47.4±2.9 12.5±1.2 17.4±1.6 0.77±0.04#194.4±10.3 14.5±1.2 19.6±1.2#398.3±7.2*DCM組49.1±3.8 8.7±0.8*20.0±1.8*0.40±0.02#163.9±7.5 12.1±1.2*13.5±1.0#348.4±7.7#

圖2 各組氧化還原水平分析Fig.2 Redox level analysis among each group

3 討論

DCM的發(fā)生機(jī)制主要涉及以下幾種因素:鈣離子平衡紊亂、線粒體功能失調(diào)、代謝底物利用異常等［8］，而氧化應(yīng)激增強(qiáng)是各因素的中心環(huán)節(jié)［9］。糖尿病狀態(tài)下心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，可給予外源性抗氧化劑進(jìn)行治療，但是由于其本身的毒副作用，其療效并不十分理想。因而，內(nèi)源性抗氧化劑成為當(dāng)今治療及預(yù)防DCM的靶點(diǎn)，首先我們必須清楚糖尿病及DCM，患者體內(nèi)這些內(nèi)源性抗氧化劑水平是如何變化的，程度如何？

糖尿病狀態(tài)下會(huì)引起一系列內(nèi)源性抗氧化體系的改變，其中抗氧化肽是心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激體系的重要組成成分。生物體內(nèi)的天然抗氧化肽主要為肌肽和谷胱甘肽。肌肽（carnosine）是一種天然的、具有高效生物活性的水溶性二肽，具有很強(qiáng)的抗氧化活性［10］，肌肽能夠抑制生物體內(nèi)整個(gè)過氧化鏈中的每一步氧化反應(yīng)。然而，糖尿病和DCM患者血清肌肽水平如何？目前未見報(bào)道。劉亞麗等應(yīng)用HPLC?UV分析心肌肌肉組織中內(nèi)源性肌肽濃度，糖尿病大鼠組與正常大鼠組相比較顯著降低［11］。本研究結(jié)果顯示，DM和DCM患者血清肌肽水平降低，其中DCM組與對(duì)照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果表明DCM時(shí)抗氧化能力降低，氧化應(yīng)激失衡。本研究結(jié)果與上述報(bào)道相一致，并進(jìn)一步在DCM患者機(jī)體內(nèi)進(jìn)行證實(shí)。

谷胱甘肽系統(tǒng)是機(jī)體重要的抗氧化體系，在維持機(jī)體還原狀態(tài)，防止自由基損傷等方面起著重要作用［12］。DM患者血清還原型谷胱甘肽（GSH）、GSH 過氧化物酶（GSH?Px）和谷胱甘肽還原酶（GR）的活性降低，而DCM患者血清谷胱甘肽系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)的水平未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，DM和DCM時(shí)機(jī)體谷胱甘肽系統(tǒng)異常，T?GSH含量差異無顯著性，還原型GSH降低，氧化型GSSG升高，GSH/GSSG比值降低，GRAC及GST等活性降低，表明機(jī)體氧化水平增強(qiáng)，抗氧化能力減弱，氧化還原狀態(tài)失衡。

NO是內(nèi)皮源性舒張因子，同時(shí)也是一種自由基，對(duì)心臟具有損傷與保護(hù)雙重作用。一氧化氮合酶（NOS）有內(nèi)皮型（eNOS）、誘導(dǎo)型（iNOS）和神經(jīng)元型（nNOS）三種亞型，在心肌中均有表達(dá)，eNOS、nNOS合成的NO對(duì)心臟具有保護(hù)作用，iN?OS合成的NO對(duì)心臟具有損傷作用，是DCM及心肌細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因子。本研究結(jié)果顯示，NO含量DCM組較對(duì)照組顯著升高，TNOS活性差異無顯著性，iNOS活性DCM組較對(duì)照組顯著升高。表明DCM時(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng)，心肌細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。過氧化氫是一種活性氧，可被過氧化氫酶分解。本研究結(jié)果與以往報(bào)道相一致，DCM時(shí)氧化應(yīng)激增強(qiáng)ROS生成增加，過氧化氫增加同時(shí)過氧化氫酶活性下降。

肌肽和谷胱甘肽是生物體內(nèi)主要的天然抗氧化肽［13?15］，此外還有大量抗氧化蛋白如谷氧還蛋白、硫氧還蛋白等。谷胱甘肽是谷氧還蛋白的輔因子，維持谷氧還蛋白還原狀態(tài)。氧化脅迫或能量缺失時(shí)GSH缺少、GSSG積累，可導(dǎo)致氧化態(tài)谷氧還蛋白1增加。本研究只檢測(cè)了DM和DCM患者血清中肌肽和谷胱甘肽系統(tǒng)的變化，今后我們會(huì)進(jìn)一步檢測(cè)抗氧化蛋白的水平，并探討這些內(nèi)源性抗氧化劑之間的作用關(guān)系，為尋找高效的內(nèi)源性抗氧化體系奠定理論基礎(chǔ)。

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