白藜蘆醇對糖尿病大鼠視網膜Bcl?2和Bax表達的影響

李青春 邢怡橋 李岱

1湖北科技學院眼科教研室（湖北咸寧437100）；2武漢大學人民醫院眼科中心（武漢430060）

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥，也是全球最常見的致盲性眼病之一。近年來研究［1?2］證實，視網膜神經細胞的凋亡是DR的關鍵組成部分，對其凋亡的干預，能夠抑制或延緩DR的發生發展。有研究發現，糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡與Bcl?2和Bax等相關［3］。白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種多酚類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性。有研究表明［4］Res具有抗凋亡作用，但作用于DR的機制尚不明確。因此，本研究擬通過觀察Res對糖尿病大鼠視網膜中Bcl?2和Bax表達的影響，探討Res防治DR的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 Res和STZ均購自美國sigma公司，Bax、Bcl?2 單克隆抗體均購自美國 Cell Signal?ing Technology公司，SP、DAB試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 動物的造模及分組 SPF級雄性SD大鼠35只由湖北科技學院動物實驗中心［許可證號：SYXK（鄂）2013?0071）］提供，平均體質量（250±10）g。隨機選取其中10只大鼠作為正常對照組（Control組），注射等量的檸檬酸緩沖液，而另外25只參照付書華等［5］的方法制備糖尿病模型。最終20只大鼠血糖達到要求，被作為糖尿病模型大鼠。用隨機數字表法將20只糖尿病模型大鼠分為糖尿病組（DM組）和Res藥物干預組（DM+Res組），每組10只。DM+Res組每日按20 mg/（kg·d）量［6］給予Res灌胃1次（將Res溶于0.5%羧甲基纖維素制成混懸液）；Control組及DM病組均給予容量與體質量相同的生理鹽水灌胃，連續灌胃12周后處死，并取其眼球。

1.3 實驗方法及結果判定 各組大鼠眼球行常規固定、包埋、切片、HE染色后每張切片隨機取5個視野（400×）觀察大鼠視網膜形態變化并拍照。在距離鋸齒緣附近500～600 μm處隨機選取3個點測定視網膜全層及內核層、外核層的厚度［7］。免疫組織化學法按SP試劑盒操作步驟實施，胞內有棕黃色顆粒的為陽性細胞。每組取5張切片，每張切片隨機選取5個視野，選取相同的放大倍數（400×）和光強度對切片上免疫組織化學陽性染色進行測定。Image?Pro Plus6.0軟件下分析照片，得出陽性的累積光密度值（IOD），Bcl?2和Bax表達量與IOD值成正比。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。計量數據采用±s表示，兩兩比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Res對視網膜厚度的影響 與Control組相比，DM組大鼠視網膜總厚度、內核層及外核層厚度均顯著減少（P＜0.01，圖1A）；與DM組相比，DM+Res組大鼠視網膜總厚度、內核層及外核層厚度均顯著增厚（P ＜ 0.05，圖1B、C、D）。Control組與DM+Res組大鼠視網膜總厚度、內核層及外核層厚度相比差異無顯著性（P＞0.05）。

圖1 Res對視網膜形態和視網膜厚度的影響Fig.1 Effect of Res on the morphology and thickness of retinas in diabetic rats

2.2 Res對視網膜Bcl?2和Bax表達的影響 Bcl?2和Bax免疫陽性產物呈棕黃色細顆粒狀，位于細胞漿內，主要分布于視網膜神經節細胞層及內核層。見圖2A。與Control組相比，DM組Bcl?2表達減弱（P ＜ 0.01），Bax表達增強（P ＜ 0.01），Bcl?2/Bax比值下降（P ＜0.01）；與DM組相比，DM+Res組Bcl?2表達增強（P ＜0.01），Bax表達減弱（P ＜0.01），Bcl?2/Bax比值上升（P ＜ 0.01）。見圖2B、C、D。Control組與DM+Res組大鼠視網膜Bcl?2、Bax蛋白表達及Bcl?2/Bax比值差異無顯著性（P＞0.05）。

圖2 Res對視網膜Bax和Bcl?2表達的影響Fig.2 Effect of Res on Bax and Bcl?2 expression in retinas of the diabetic rats

3 討論

早在20世紀90年代末，視網膜神經退行性病變的概念就被提出。近年來研究［8］表明視網膜神經損傷在DR發生發展中愈發突出，其主要表現為視網膜厚度變薄及凋亡細胞數增加等。Res是一種多酚類化合物，具有廣泛的生物和藥理活性，前期研究發現其對白內障、青光眼、年齡相關性黃斑變性等眼部疾病具有防治作用［9］。本研究發現Res可顯著抑制糖尿病大鼠視網膜總厚度、內核層和外核層厚度變薄；且與正常對照組大鼠視網膜厚度差異無顯著性，表明Res可通過減輕糖尿病大鼠視網膜的病理變化，延緩DR的進程。

有研究［10］表明視網膜神經損傷是由多種凋亡相關基因參與的調控過程。其中負責編碼的Bcl?2蛋白，能阻止多種信號通路阻斷細胞凋亡、延長細胞的存活期；而Bax是一種能促使或介導細胞凋亡的線粒體膜蛋白［11］，一定條件下兩者可相互結合成二聚體。當Bcl?2表達過量時，便形成Bcl?2/Bcl?2同源二聚體，抑制細胞凋亡，使細胞受到保護；而當Bax過度表達時，不僅可與Bcl?2形成Bcl?2/Bax異源二聚體，拮抗Bcl?2抑制凋亡的作用，還可與Bax形成Bax/Bax同源二聚體，激活Caspases介導的細胞凋亡［12］。Bcl?2/Bax的比值可反映 Bcl?2和Bax在細胞凋亡中的效應，兩者的平衡能保證細胞的穩態，比值的變化是細胞存活或凋亡的決定因素［13］。當 Bcl?2/Bax比值升高時，其效應是抑制細胞凋亡，反之，則是促進細胞凋亡。

有研究證實Res可通過增加Ca2+/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ的活性，抑制STZ誘導的糖尿病小鼠神經節細胞的凋亡［14］。本研究通過檢測STZ誘導的糖尿病大鼠視網膜細胞中Bcl?2及Bax蛋白強度，發現視網膜中的Bcl?2蛋白表達下降而Bax蛋白表達顯著增多，Bcl?2/Bax的比值明顯減小，與很多學者關于神經細胞凋亡的研究結果相似［15?16］，說明Bcl?2及Bax參與了實驗性糖尿病大鼠視網膜神經細胞凋亡。而采用Res干預的糖尿病大鼠視網膜中Bcl?2蛋白表達增加，Bax蛋白表達減少，Bcl?2/Bax的比值升高，且與正常對照組大鼠視網膜Bcl?2 及 Bax表達相當，表明 Res可通過上調 Bcl?2的表達和下調Bax的表達，調整Bcl?2/Bax比值趨于正常化而發揮抗凋亡的作用。

綜上所述，Res能減輕糖尿病大鼠視網膜的病理變化，并通過上調Bcl?2的表達及下調Bax的表達，提高Bcl?2/Bax比值，抑制視網膜神經節的細胞凋亡，從而延緩糖尿病視網膜病變的發生發展。本研究僅探討了Res對Bcl?2和Bax的影響，Res是否能通過其他作用機制對DR起防治作用，將是今后的研究方向。

參考文獻

［1］ HAMMOUM I，BENLARBI M，DELLAA A，et al.Study of reti?nal neurodegeneration and maculopathy in diabetic Meriones shawi：A particular animal model with human-like macula［J］.J Comp Neurol，2017，525（13）：2890?2914.

［2］ SRINIVASAN S，PRITCHARD N，VAGENAS D，et al.Retinal Tissue Thickness is Reduced in Diabetic Peripheral Neuropathy［J］.Curr Eye Res，2016，41（10）：1359?1366.

［3］ MALIK S，SUCHAL K，KHAN S I，et al.Apigenin ameliorates streptozotocin?induced diabetic nephropathy in rats via MAPK?NF?κB?TNF?α and TGF?β1?MAPK?fibronectin pathways［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2017，313（2）：F414?F422.

［4］ TAKASHINA M，INOUE S，TOMIHARA K，et al.Different ef?fect of resveratrol to induction of apoptosis depending on the type of human cancer cells［J］.Int J Oncol，2017，50（3）：787?797.

［5］ 付書華，詹昶，仇晶晶，等.HSP60在早期糖尿病大鼠晶狀體上皮細胞的表達［J］.眼科新進展，2015，35（1）：22?24.

［6］ KIM Y H，KIM Y S，KANG S S，et al.Resveratrol inhibits neu?ronal apoptosis and elevated Ca2+/calmodulin?dependent protein kinase ii activity in diabetic mouse retina［J］.Diabetes，2010，59（7）：1825?1835.

［7］ MATSUDA T，NODA K，MURATA M，et al.Vascular adhesion protein?1 blockade suppresses ocular inflammation after retinal laser photocoagulation in mice［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2017，58（7）：3254?3261.

［8］ EZQUER F，EZQUER M，ARANGO?RODRIGUEZ M，et al.Could donor multipotent mesenchymal stromal cells prevent or delay the onset of diabetic retinopathy？［J］.Acta Ophthalmol，2014 ，92（2）：e86?95.

［9］ 李青春，李岱.白藜蘆醇對眼部疾病防治機制的研究進展［J］.實用醫學雜志，2014，30（24）：4044?4046.

［10］ DE MORAES G，LAYTON C J.Therapeutic targeting of diabetic retinal neuropathy as a strategy in preventing diabetic retinopathy［J］.Clin Exp Ophthalmol，2016 ，44（9）：838?852.

［11］ LEE M H，HONG S H，PARK C，et al.Hwang?Heuk?San induc?es apoptosis in HCT116 human colorectal cancer cells through the ROS?mediated activation of caspases and the inactivation of the PI3K/Akt signaling pathway［J］.Oncol Rep，2016，36（1）：205?214.

［12］ MOSHREFI M，SPOTIN A，KAFIL H S，et al.Tumor suppres?sor p53 induces apoptosis of host lymphocytes experimentally in?fected by Leishmania major，by activation of Bax and caspase?3：a possible survival mechanism for the parasite［J］.Parasitol Res，2017，116（8）：2159?2166.

［13］ KARCH J，MOLKENTIN J D.Regulated necrotic cell death：the passive aggressive side of Bax and Bak［J］.Circ Res，2015，116（11）：1800?1809.

［14］ WANG W，YU Y，LI J，et al.The analgesic effect of trans?resve?ratrol is regulated by calcium channels in the hippocampus of mice［J］.Metab Brain Dis，2017，32（4）：1311?1321.

［15］ ZANONI D S，DA SILVA G A，EZRA?ELIA R，et al.Histologi?cal，morphometric，protein and gene expression analyses of rat retinas with ischaemia?reperfusion injury model treated with sildenafil citrate［J］.Int J Exp Pathol，2017，98（3）：147?157.

［16］ BORIUSHKIN E，WANG J J，LI J，et al.Identification of p58IPK as a novel neuroprotective factor for retinal neurons［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2015，56（2）：1374?1386.