HPLC-DAD法對補腎壯陽類藥品中非法添加PDE5的檢測分析

謝 輝

（常德市食品藥品檢驗所，湖南 常德 415000）

補腎壯陽類藥品中非法添加化學物質，有助疾病的愈合，但添加化學物質必須要經過嚴格的試驗來確保其安全[1]。近年來，一些不法商家為追求利益，在藥品中擅自添加PDE5類成分，患者在不知情下服用未知成分的藥品，很容易產生嚴重不良反應。目前在補腎壯陽類藥品中常添加PDE5[2-3]。本文以補腎壯陽類藥品為樣品，采用高效液相色譜法，探討測定PDE5的方法，通過比較樣品與對照品的保留時間和DAD是否一致來確定樣品是否添加PDE5成分，同時建立檢測PDE5成分的快速檢驗方法，為更好打擊不法行為提供可靠的技術保障。

1 材料與方法

1.1 儀器：Waterse2695高效液相色譜儀（含Waters2484二極管陣列檢測器）；AG135分析天平。

1.2 試劑：水為超純水，甲醇、乙腈為色譜級，磷酸、三乙胺為分析純；對照品：紅地那非（批號：2-ACH-50-1），伐地那非（批號：9-SSR-78-1），豪莫西地那非（批號：11-MVI-176-1），西地那非（批號：15-ABY-7-1-PFZ），氨基他達拉非（批號：4-WSM-124-1），他達拉非（批號：8-SSR-172-1），偽伐地拉非（批號：1-BIN-18-2），均來自Toronto Research Chemicals Inc補腎壯陽類藥品（樣品1未檢出他達拉非，樣品2檢出他達拉非），均購于某醫藥公司。

2 方法與結果

2.1 供試液的制備

2.1.1 對照品溶液的配制。混合對照品的配制，精密稱取對照品：紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非10 mg，置20 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1mL，置10 mL量瓶中，用流動相A溶液稀釋成50 μg/mL，即得混合對照品。

他達拉非對照品的配制，精密稱取他達拉非10 mg，置20 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用流動相A溶液稀釋成50 μg/mL。

2.1.2 樣品溶液的制備。樣品1溶液的配制：精密稱取1 g，研細，置50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超聲處理15 min，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

樣品2溶液的制備：精密稱取1 g，研細，置50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，超聲處理15 min，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱：Promosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：流動相A為磷酸三乙胺溶液（取三乙胺7 mL用水稀釋至1000 mL，用磷酸調pH至2.8）-甲醇-乙腈（60∶20∶20）和流動相B磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8∶46∶46）（流動相程序見表1）；柱溫：35 ℃；流速為1.0 mL/min；檢測波長：230 nm。進樣量為10 μL，分離度均應＞1.5[1]。理論板數按他達拉非計算應不低于3000[1]。

表1 流動相程序

2.3 方法的專屬性：取對照品溶液、樣品1溶液，樣品2溶液在上述色譜條件下進樣10 uL，分別記錄色譜圖（圖1）。對照品溶液的圖譜A顯示紅地那非、伐地那非、西地那非、豪莫西地拉非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非保留時間約為9.5、11.0、14.5、15.7、18.4、20.4、25.1 min，樣品1溶液色譜圖B表明此藥物不含所測對照品的化合物；樣品2溶液的色譜圖C與混合對照品溶液（A）和他達拉非對照品（D）色譜圖比較，他達拉非對照品保留時間為20.4 min，樣品2溶液保留時間為20.4 min，樣品2溶液出現了與他達拉非保留時間一致的藥物。比較對照品溶液A和樣品2溶液C的DAD圖，見圖2，對照品溶液A和樣品2溶液C他達拉非對照品的DAD顯示為283 nm，樣品2溶液中DAD顯示為284 nm；二者的保留時間，DAD基本一致，可判定為樣品2含有他達拉非。

圖l 混合對照品溶液（A）、樣品1溶液（B）、樣品2溶液（C）、他達拉非對照品（D）的HPLC色譜圖

圖2 他達拉非對照品（A）、樣品2溶液（B）的DAD光譜圖

2.4 線性關系：按上述試驗方法配制每種對照品溶液，在上述色譜條件下進行分析，以各組分質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，各對照品的線性均較好，相關系數均符合要求。

2.4 精密度試驗：按上述試驗方法配制每種對照品溶液，分別精密吸取同一對照品溶液，在相同的色譜條件下重復進樣6次。分別測定峰面積值，結果紅地那非、伐地那非、偽伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非。峰面積的RSD（n=6）分別為0.91%、0.86%、1.01%、0.95%、0.88%、0.96%、0.87%。

2.5 穩定性試驗：吸取紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非于0、2、4、6、8、12 h進樣測定其峰面積，結果紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非峰面積的RSD分別為1.11%、0.96%、1.31%、0.99%、0.98%、0.99%、1.07%。（n=6），表明對照品溶液在12 h內穩定。

2.6 加樣回收率試驗：取用于本實驗的市售樣品9份，各精密稱取0.5 g，置50 mL量瓶中，按低、中、高濃度分別精密加入紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非對照品溶液，每一濃度3份，加乙腈40 mL，超聲處理15 min，冷至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。按上述色譜條件測定，紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非對照品的回收率為97.2%、95.8%、96.4%、96.5%、93.7%、89.9%、91.2%；RSD分別為1.96%、1.89%、2.10%、1.93%、1.86%、1.90%、1.85%。

3 討 論

3.1 流動相的選擇：為同時檢出補腎壯陽類藥品中中非法添加化學物質，參考相關文獻[4]，曾試用不同比例流動相如甲醇-乙腈-水（35∶5∶60），甲醇-乙腈（85∶15），流動相A為磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（60∶20∶20）和流動相B磷酸三乙胺溶液-甲醇-乙腈（8∶46∶46），進行梯度洗脫，進樣10 μL進行檢測，以所選流動相系統檢出的色譜峰最理想，色譜峰能達到基線分離，色譜行為良好，故選此系統作為流動相進行試驗。

3.2 色譜波長的選擇：分別對這6種化學物質進行紫外掃描，選取230 nm測定紅地那非、伐地那非、豪莫西地那非、西地那非、氨基他達拉非、他達拉非、偽伐地拉非吸收響應值比較好，故采用230 nm波長處的色譜圖。

3.3 DAD檢測器的定性確認作用：本實驗采用二極管陣列檢測器，在190～400 nm內掃描，得到每種化合物的紫外特征光譜圖，結合高效液相色譜的保留時間進一步定性，使實驗結果更準確可靠。

3.4 采用本法發現購買的市售藥品中添加他達拉非，更加證實了其方法的可行性，故可以作為補腎壯陽類藥品中添加PDE5快速判定測定的檢測方法。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典(一部)[M].北京:中國醫藥科技出版社,2015:283-284.

[2] 倪晨、陳汀波、梁遠園.某藥酒中非法添加PDE5抑制劑的HPLC檢測[J].中國中醫藥物現代遠程教育,2011,9(11):162-163.

[3] 劉暢、夏晶、胡青,等.LC/MS(n)法檢測補腎壯陽類中成藥和保健食品中非法添加5種性功能類化學藥品[J].中成藥,2009,31(9):1371-1374.

[4] 施法,候峰,陸軍,等.HPLC-DAD法同時測定更年安片中6個活性成分的含量[J].藥物分析雜志,2012,32(1):47-51.