重組體pshRNA-dnmt1對(duì)肝癌細(xì)胞dnmt1基因表達(dá)的抑制作用

傅 敏 徐曉容*

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400011）

目前認(rèn)為DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而在基因組DNA甲基化過(guò)程中DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（dnmt）發(fā)揮的作用十分重要。研究表明，dnmt1對(duì)成人細(xì)胞基因組 DNA 甲基化的維護(hù)起關(guān)鍵作用[1]。dnmt1在正常人細(xì)胞中的表達(dá)很低，而在肝癌、胃癌等多種腫瘤中卻表達(dá)過(guò)度，這提示dnmt1可能成為腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。為此，本文擬將靶向dnmt1的shRNA干擾重組體轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，觀察其對(duì)細(xì)胞中dnmt1基因表達(dá)的抑制作用，以為肝癌的發(fā)生機(jī)制及基因治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑：人肝癌細(xì)胞株SMCC-7721及大腸桿菌Jm109為重慶醫(yī)科大學(xué)病毒性肝炎研究所保存。質(zhì)粒pTZU6+1來(lái)自美國(guó)。限制性?xún)?nèi)切酶包括HindⅢ、EcoRI、SalI、XbalI等，均購(gòu)自羅氏；使用TaKaRa生產(chǎn)的T4 DNA連接酶；質(zhì)粒提取使用Promega生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒；DNA純化使用上海生工生物生產(chǎn)的DNA純化試劑盒；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒來(lái)自QIAGEN0；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（Invitrogen）；DNA片段（北方同正生物）；Total RNA Kits、OneStep RT-PCR Kit試劑盒（QIAGEN）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（二抗）（北京中山生物）；胎牛血清、新生小牛血清（Hyclone）；兔抗人DNMT1多抗（Santa Crutz）；化學(xué)顯色試劑（PIERCE）；其余生化試劑均系國(guó)內(nèi)公司產(chǎn)品。

1.2 方法：根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則、載體pTZU6＋1的酶切位點(diǎn)及GenBank中dnmt1的編碼序列（No NM001379），合成針對(duì)dnmt1編碼區(qū)126～144 bp為靶向的DNA片段。 shRNA的核苷酸序列如下：正義鏈 ：5-TCGAGCAGGCGGCT CAAAGAT TTGTTCGCAAATC TTTGAGCCGCCTGCTTTTT-3'，帶有XhoI的酶切位點(diǎn)。反義鏈：5-CTAGAAAAAGCAGGCGGCTCAAAGATTTGCG AACA AATCT TT GAGCCGCCTGC-3'，帶有 XbaⅠ的酶切位點(diǎn)。將合成的DNA片段退火形成雙鏈DNA，構(gòu)建重組體pshRNA-dnmt1，按試劑盒說(shuō)明書(shū)應(yīng)用QIAGEBN EndoFreeTM Plasmid Maxi Kit提取重組質(zhì)粒pshRNA-dnmt1。轉(zhuǎn)染過(guò)程按Invitrogen轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。按以下分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：空白對(duì)照組（予脂質(zhì)體）、空白載體對(duì)照組（予pTZU6＋1）和實(shí)驗(yàn)組（予pshRNA-dnmt1）。

1.3 RT-PCR法：將轉(zhuǎn)染前、轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的各組細(xì)胞用胰酶消化，PBS洗3次后離心收集細(xì)胞，按Total RNA Kits試劑盒說(shuō)明提取總RNA。按照OneStep RT-PCR Kit 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR，RT-PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)引物：dnmt1基因引物：正義鏈5'-TGCAGAAGG ATGGAACGGAG-3'，反義鏈5'-GCTTTTCCTTGTAATCCTGG-3'（640 bp）。β-actin基因引物：正義鏈5'-TGGCACCACACCTTCTACAA-3'，反義鏈5'-GCAGCTCGTAGCTCTTC TCC-3'（472 bp）。反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 50 s；72 ℃ 10 min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后行瓊脂糖凝膠電泳，使用ImageMaster TotalLab儀器分析β-actin和dnmt1基因擴(kuò)增條帶的灰度值。根據(jù)β-actin基因片段條帶的強(qiáng)弱判斷模板的量，進(jìn)而判斷肝癌SMMC-7721細(xì)胞株內(nèi)dnmt1 mRNA被沉寂的程度。

1.4 Western blot法：同上文將轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h的各組細(xì)胞消化、處理后，每管沉淀加60 μL蛋白上樣Buffer煮沸5 min，混勻，-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)《分子克隆》實(shí)驗(yàn)操作指南進(jìn)行Western Blot雜交。然后加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影顯影、曝光，使用Syngene Bio Imaging檢測(cè)dnmt1蛋白的表達(dá)。抑制率 = （未轉(zhuǎn)染組－轉(zhuǎn)染組） /未轉(zhuǎn)染組 ×100%。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pshRNA-dnmt1的構(gòu)建和鑒定：重組質(zhì)粒pshRNA-dnmt1的構(gòu)建和鑒定部分結(jié)果已發(fā)表于《重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》[2]。

2.2 肝癌SMMC-7721細(xì)胞株中dnmt1基因mRNA水平：5組泳道中細(xì)胞內(nèi)源β-actin基因擴(kuò)增片段條帶的亮度相近，說(shuō)明RT-PCR中加入模板的量無(wú)差異，而dnmt1 PCR擴(kuò)增帶亮度有明顯差異，與空白對(duì)照組和空白載體對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組亮度明顯減弱（圖1）。以空白對(duì)照組中dnmt1 PCR擴(kuò)增條帶為標(biāo)準(zhǔn)（亮度100），空白載體對(duì)照組的亮度是空白對(duì)照組的98.8%，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的亮度分別是空白對(duì)照組的58.4%、37.0%和15.9%，重組體pshRNA-dnmt1對(duì)肝癌細(xì)胞dnmt1基因的抑制率分別為41.6%、63.0%、84.1%。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 肝癌SMMC-7721細(xì)胞株中dnmt1蛋白的表達(dá)：5組參照 β-actin蛋白的表達(dá)相近，而與空白對(duì)照組和空白載體對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組dnmt1蛋白雜交帶明顯減弱（圖2）。空白載體對(duì)照組的亮度是空白對(duì)照組的99.1%，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h的亮度分別是空白對(duì)照組的51.8%、31.5%和18.5%，重組體pshRNA-dnmt1對(duì)肝癌細(xì)胞dnmt1蛋白的抑制率分別為48.2%、68.5%、81.5%。

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

正常情況下，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島是處于非甲基化狀態(tài)，而在甲基化后則會(huì)造成基因轉(zhuǎn)錄沉默，從而導(dǎo)致DNA 修復(fù)基因、抑癌基因等基因失去正常功能，使細(xì)胞生長(zhǎng)分化及 DNA 損傷修復(fù)出現(xiàn)異常。Dnmt直接參與了基因組DNA甲基化的過(guò)程，并能通過(guò)抑制抑癌蛋白表達(dá)、促進(jìn)癌蛋白表達(dá)來(lái)參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Dnmt1與肝癌的關(guān)系密切，肝癌組織中的dnmt1 蛋白顯著表達(dá)，并與患者的惡性病理特征及預(yù)后密切有關(guān)。

目前dnmt1 基因已成為人們十分關(guān)注的一個(gè)腫瘤基因治療的靶點(diǎn)，也許可以通過(guò)抑制其表達(dá)而使一些因啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化而沉寂的抑癌基因重新活化和表達(dá)，從而達(dá)到腫瘤治療的目的。本研究結(jié)果顯示重組體pshRNA-dnmt1轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)dnmt1基因的mRNA水平明顯下降，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h分別為41.6%、63.0%、84.1%；同時(shí)細(xì)胞內(nèi)dnmt1蛋白表達(dá)明顯下降，抑制率分別為48.2%、68.5%、81.5%，提示重組體pshRNA-dnmt1能有效地、特異地抑制肝癌細(xì)胞內(nèi)dnmt1基因的表達(dá)，有望成為肝癌治療的靶點(diǎn)。

本次體外研究初步證實(shí)了重組體pshRNA-dnmt1能明顯抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞株內(nèi)dnmt1基因的表達(dá)，但研究dnmt1基因功能及肝癌的基因治療是一項(xiàng)浩大的工程，仍有很多問(wèn)題尚待解決，如：dnmt1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、凋亡的影響以及是通過(guò)何種信號(hào)傳導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的；重組體pshRNA-dnmt1對(duì)正常細(xì)胞是否也有影響；體內(nèi)試驗(yàn)及體內(nèi)毒理學(xué)等。

參考文獻(xiàn)

[1] 王勇,狄鎮(zhèn)海.肝癌DNA甲基化的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,17(22):3404-3406.

[2] 陳道榮,王丕龍,黃愛(ài)龍.DNMT1靶向RNA干擾重組體的構(gòu)建及序列分析[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2004,29(3):269-272.