Catsperg1基因在大鼠睪丸發育中轉錄表達的分析*

韋龍生 韓 璐 楊 錚 王麗佳 王羚鴻 劉陶迪** 張信來

1.內蒙古醫科大學心身醫學研究室（內蒙古呼和浩特 010110）；2.山西醫科大學汾陽學院；3.內蒙古醫科大學附屬醫院普外科

Abstract ObjectiveTo study the transcriptional expression ofCatsperg1in the development of rat testes and its effect on sperm maturation.MethodsMale Wistar rats at 21 time points of age (frome 2 to 65 days) were given, and their testis tissues at three different litter were collected at each time point.Total mRNA was extracted from rat testis tissues and reverse transcribed into cDNA, and then amplified for detection the transcription expression ofCatsperg1by real-time PCR.ResultsThe mRNA expression ofCatsperg1began to increase slowly at the 20th day after birth, reached the peak at the 50th and 55th day, and remained at the peak at the 60th and 65th day.ConclusionThe expression ofCatsperg1in rat testis gradually increased, which may be involved in the regulation of sperm maturation.

Key wordsCatsperg1; gene expression; spermatogenesis; rats; sperm maturation

近年來，不育不孕的發病率逐年提高，困擾著許多已婚夫婦，其中男方因素約占百分之五十，導致男性不育的原因有很多，其中包括精液異常、生精障礙、輸精管梗阻和全身性因素（精神和環境因素、營養因素、內分泌疾病），其中生精障礙是引起男性不育的重要原因。

精子發生的分子機制是當前精原干細胞研究的熱點。盡管參與精子發生的眾多基因有許多生物學特征[1]，但在基因轉錄表達峰值方面主要體現在三個階段：第一，有絲分裂階段，即出生后0～8d，此時精原干細胞以增殖為主；第二，減數分裂開始，即出生后14d左右，此時初級精母細胞出現；第三，進入精子發生之后，即出生20d之后，此時圓形精子首次出現[2,3]，出生35d后完成圓形精子向長形精子的變形，成熟的精子出現。出生56d后大鼠性成熟，達到成年狀態[4,5]。

大鼠中的Catsperg1基因，也叫Catsperg基因，兩者為同源性基因。Catsperg基因是Catsper精子鈣通道上的一個亞基[6]，是精子超激活運動和男性生育能力所必需的基因,精子細胞過度活化可能是通過Catsper1，精子細胞過度活化是精子活力所必需的，精子活力是精子受精過程所需條件。

本實驗通過Real-time PCR技術，檢測大鼠睪丸組織Catsperg1基因的mRNA表達情況，為進一步研究該基因的蛋白表達情況提供依據，從而研究該基因在精子功能中的作用。

材料與方法

一、材料

總RNA提取試劑盒（DP419）購自TIANGEN公司，反轉錄及實時定量PCR試劑從大連寶生物公司購買，引物由上海生物工程公司合成。

二、實驗動物

從內蒙古大學購買出生10周左右的Wistar大鼠，并在內蒙古醫科大學動物中心飼養，將雄鼠與雌鼠合籠，自然交配，每周換墊料1次，保持飼料和飲水的干凈和充足。第8天后分籠，第18～20天后開始每天觀察雌鼠3次，記錄鼠出生的具體時間。出生當天記成第1天（1日齡），編號飼養。

三、實驗樣本采集

將出生后2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65日齡的雄鼠用脊椎脫臼法處死，取睪丸組織，每個日齡取3只不同窩別的大鼠。

1.各個時間點總RNA的提取

取出的睪丸組織按照總RNA提取試劑盒（TIANGEN，DP419）上的使用說明書進行操作，從總的RNA管中分裝出2μL在超微量紫外分光光度儀（ Thermo ND 2000L）測定其RNA濃度(Conc)和純度(A260：A280比值)，RNA濃度測3次取其平均值，A260/A280比值保持在1.95～2.10之間。總的RNA管放入-80℃冰箱保存。

四、RNA反轉錄為cDNA

規定稀釋后每管樣品質量為1μg，濃度為0.15μg/μL，根據測得樣品的RNA濃度，可以計算出所需mRNA體積。反轉錄體系為20μL， A液10μL（稀釋后RNA 6.67μL，10μm oligo-dt 1μL，RNase-Free dH2O 2.33μL），B液10μL（5×RT-MMlV Buffer 4μL，dNTPs(10mM)2μL，RRI(10μ/μL)1μL，RT-M-Mlv 0.5μL，RNase-Free H2O 2.5μL），A液65℃水浴5min，B液與A液混合后42℃水浴1h，70℃水浴10min，最后-20℃保存。

五、Catsperg1基因引物設計

引物序列見表1。

表1 寡核苷酸引物列表

六、Real-time PCR方法檢測Catsperg1的轉錄表達

以該 cDNA 為模板對部分Catsperg1片段進行擴增，在8×12的96板孔中，在每個孔20μL的反應液總體積中依次加入下列物質：RNase-Free dH2O 7μL，兩個引物各0.8μL，Extaq酶 10μL，Rox 0.4μL，cDNA 1μL，按照第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的21個時間點的cDNA依次加入反應液，每個時間點反應液重復一次，并帶兩個相應時間點的GAPDH的反應液，GAPDH做內參對照，H2O做陰性對照，采用Ct方法分析Catsperg1mRNA的表達量，結果用基因mRNA相對表達倍數表示，計算方法用2-ΔΔCt法，數據和圖表使用Microsoft Excel軟件分析[7]。

結 果

一、Real-time PCR檢測Catsperg1基因在三組不同窩別大鼠早期發育睪丸組織中mRNA水平的表達情況

根據引物的溶解曲線可知，重合度高，其特異性好（圖1A，圖1C）。擴增曲線在PCR平臺期幾乎重合（圖1B，圖1D）。

通過Real-time PCR反應檢測到Catsperg1基因在3組不同窩別的大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天睪丸組織中的表達模式（圖2），3組不同窩別的大鼠睪丸組織mRNA水平表達趨勢基本一致；第2天至第65天的大鼠睪丸組織mRNA表達差異明顯。Catsperg1mRNA表達在第2天到第16天幾乎沒有，到第20天開始逐漸增加，到第29天達到一個小高峰又逐漸下降到第30天，之后從第30天到65天表達再次迅速升高，形成一個高峰，并維持一定峰值。

圖1 Catsperg1和Gapdh的溶解曲線和擴增曲線

圖2 Catsperg1基因在3組不同窩別大鼠出生后第2天至第65天睪丸組織中mRNA的相對表達量

討 論

哺乳動物精子發生是一種細胞分化的連續體，其中可以分為3個主要階段：精原細胞的增殖，減數分裂和精子形成。精子發生由干細胞（原始型A型精原細胞）的分裂引發，Ap型精原細胞分化增殖為兩個 B 型精原細胞。B型精原細胞分裂增殖為初級精母細胞，精母細胞經歷了減數分裂的不同階段，第一次分裂后形成次級精母細胞，染色體數目減少一半，第二次分裂后形成圓形精子細胞， 隨后，圓形精子細胞經過復雜顯著的形態變化，形成延長的精子細胞，然后發育為成熟精子[2]。這種復雜的過程由數千個基因在生殖細胞發育的特定階段選擇性表達。在精子發生過程中，這些基因的表達在精子發生過程起調控作用。轉錄和翻譯控制機制負責時間和階段特異性表達模式[8,9]。

Catsperg1基因是Ca2+通道蛋白家族之一[10,11]，據相關研究報道該基因位于哺乳動物精子膜表面的Ca2+通道，負責胞內外 Ca2+濃度的調節，調控精子活力、超活化、精子獲能和頂體反應等生理過程[12-14]。Catsperg1基因是Catsper精子鈣通道上的一個亞基[6]，而Catsper精子鈣通道是具有電壓依賴性，Ca2+選擇性，pH敏感性。它控制帶正電Ca2+進入精子細胞，這是精子過活化和男性生殖力所必需的[15,16]。

本實驗通過對Catsperg1基因在大鼠出生后第2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65天的表達模式的檢測，可以觀察到，Catsperg1基因在大鼠出生早期，幾乎不轉錄，直到第20天mRNA表達才開始增加，在第29天有個小高峰，之后從第30天表達又逐漸增加，在第50天表達達到最高值，之后維持一定峰值。第20天正好是圓形精子出現的時間點，20d到65d，圓形精子經過復雜的變態發育后形成成熟的精子，因此可以推測Catsperg1基因可能與精子成熟有關，并在其中發揮重要的作用。

通過上述實驗結果可以總結以下結論：（1）Catsperg1基因表達與精子發生有相關性；（2）Catsperg1基因在大鼠睪丸組織中晚期發育的表達量逐漸升高，可能參與精子成熟。本實驗揭示了Catsperg1基因與精子有相關性，為下一步對該基因的功能研究奠定了基礎。

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