非連續密度梯度法對弱精子癥患者精子參數及DNA完整性的影響*

鄧順美 龐 韜 李月華 馬春杰 王奇玲 劉 晃 秦衛兵 劉曉華 張欣宗 唐運革

國家衛生和計劃生育委員會男性生殖與遺傳重點實驗室、廣東省計劃生育科學技術研究所（廣州 510600）

對于部分弱精子癥患者而言, 僅僅依靠藥物治療是無法獲得自然妊娠的，必須依靠人類輔助生殖技術才能使他們達到生育后代的目的。然而無論是采用人工授精，還是體外受精與胚胎移植技術（IVF-ET）都需要對精子進行制備優選, 篩選出活力更強、精子形態更好的精子來實施人類輔助生殖技術。目前，對于弱精子癥患者的精液通常采用非連續密度梯度法來優選精子，本方法優選出的精子通常精子活力和精子形態都會得到改善，但對精子功能相關參數的影響尚不明確。本實驗試圖采用非連續密度梯度法對弱精子癥患者精液進行精子制備優選，分析精子制備前后的精液質量參數和精子DNA完整性，評估非連續密度梯度法在改善精子質量參數和精子DNA完整性方面的有效性。

資料與方法

一、樣本來源

26例弱精子癥精液標本來自于2016年3月至2016年6月在廣東省計劃生育專科醫院男科門診就診的男性不育癥患者，年齡22～35歲，平均年齡（32±6）歲。弱精子癥患者準入標準為精液標本量≥1.5mL，精子濃度≥15×106/mL，精子總活力[前向運動精子（PR）+非前向運動精子（NP）]＜40%，前向運動精子（PR）百分率＜32%，正常形態精子百分率≥4%，所有樣本均排除支原體、衣原體感染， 附睪或睪丸炎，系統性疾病病史，且患者常規體格檢查正常。準入患者禁欲2～7d，采用手淫法收集精液于干燥無菌取精杯, 置于37℃恒溫水浴箱中待液化。

二、儀器與試劑

SCA精子質量分析系統，精子計數玻片均為西班牙Microptic s.l.公司產品。改良巴氏染色液來自于貝索生物技術有限公司，精子洗液、40%和80%梯度離心液購置于Gynotec公司。精子核DNA熒光染色試劑盒來自于深圳市華康公司。80i熒光顯微鏡為日本尼康公司產品。

三、精液常規及精子形態分析

使用一次性精子計數玻片（goldcyto），采用SCA精子質量分析系統對精子制備前后精子濃度、精子總活力、PR百分率進行分析。對于精子濃度大于50×106/mL的標本先進行稀釋, 然后再做精液常規分析。儀器參數設置與操作方法嚴格按照生產廠家制定的操作規程實施。采用WHO主編的《人類精液檢查與處理實驗室手冊》[1]推薦的改良巴氏染色法分析精子形態。

四、精子DNA完整率檢測

采用精子核DNA熒光染色試劑盒進行精子DNA完整性檢測分析。雙鏈DNA結合吖啶橙熒光染料后精子在熒光顯微鏡下呈現綠色熒光，單鏈DNA結合熒光染料后精子顯示紅色熒光。每份精液標本染色后，在熒光顯微鏡下記數至少200個精子，計算綠色熒光精子所占的百分率，該百分率即為精子DNA完整率。

五、非連續密度梯度法

采用WHO主編的《人類精液檢查與處理實驗室手冊》推薦的非連續密度梯度離心法對精液標本進行精子制備[1]。非連續密度梯度離心制備后的精子沉淀物用培養液統一調至0.5mL。

六、制備后檢測

對制備后的精子標本按照上述三和四所述方法進行精液常規、精子形態分析和精子DNA完整性檢測。

七、統計分析方法

采用SPSS軟件對精子制備前后各精液參數進行配對t檢驗。

結 果

26例弱精子癥患者精液標本通過非連續密度梯度離心法進行精子制備，制備前精液體積為（4.22±1.54）mL，制備后精子體積統一調至0.5mL。其他精液參數制備前后的檢測數據見表1。統計分析結果顯示精子制備后精子濃度顯著下降，精子總活力、PR百分率，正常形態精子百分率，以及精子DNA完整率較制備前顯著提高，差異均具統計學意義（P＜0.05）。

表1 26例弱精子癥患者精子制備前后各精液參數檢測結果比較（±s）

表1 26例弱精子癥患者精子制備前后各精液參數檢測結果比較（±s）

精液參數 制備前 制備后 t值 P值精子濃度ρB(106?mL-1) 51.9±44.65 18.91±24.61 4.57 0.000精子總活力(%) 22.5±6.34 31.77±21.15 -2.46 0.021 PR(%) 17.3±5.5 26.2±20.00 -2.44 0.022正常形態精子(%) 6.58±2.50 7.77±3.14 -4.14 0.000精子DNA完整率(%) 64.96±13.33 72.23±12.43 -3.38 0.001

討 論

在不育癥患者夫婦中，大約有30%～40%是由男方因素引起，15%～20%是由男女雙方因素共同所致。因此，男性因素是不育癥不可忽視的重要原因。精液參數異常是引起男性不育的常見原因，弱精子癥導致的男性不育就是其中之一。由于男性生殖系統特殊的解剖及生理特性，使得因男性因素引起的不育癥通過藥物或手術治療的效果較差，而且，約有3%～5%的不育癥屬于難治性的，必須通過輔助生殖技術才能達到妊娠的目的[2]。

弱精子癥患者由于精子活力降低導致精子穿透宮頸黏液的功能下降，無法在最佳時間內游到卵子所在位置，因而，也就導致精子的受精能力下降，甚至部分弱精子癥患者只能通過人類輔助生殖技術才能解決生育問題。無論是采用人工授精，還是IVF-ET，輔助生殖治療前都必須制備優化精子，去除精漿中使精子失去受精能力的物質。目前，常用的精液優化處理方法有簡單洗滌法、直接上游法和非連續密度梯度離心法等。對于精液參數正常的標本，多采用上游法，對于弱精子癥患者精液標本，則多采用非連續密度梯度離心法[1]。不同的精子制備方法有不同的優缺點，上游法能顯著提高PR百分率，但對提高正常形態精子百分率無明顯改善[3]；選擇非連續密度梯度離心則可富集更多活力好、形態正常的精子，有利于提高卵子的受精率[4]。精子制備方法很多，各種方法對精液常規分析參數的影響大都已有定論，但對精子DNA 完整性的影響，研究結果卻不盡相同。已有研究報道，上游法、密度梯度離心法均可以不同程度優化精液質量，顯著提高精子DNA完整率[5]，但是其研究對象均來自于精液參數正常的男性。另一方面，精子DNA損傷又與男性不育密切相關，其損傷程度與自然受孕率呈顯著負相關。有報道認為精子DNA碎片指數（DFI）≥30%，則自然生育的可能性幾乎為零[6]。本研究運用非連續密度梯度離心法對弱精子癥患者精液標本進行精子優選制備，并對制備前后的精液標本進行精液常規和精子形態分析，采用吖啶橙染色方法檢測精子DNA完整性。26例弱精子癥患者精液標本通過非連續密度梯度離心法制備精子后，精子DNA完整率較制備前明顯改善，而且精子總活力、PR和正常形態精子百分率也得到顯著提高。精子濃度較制備前之所以顯著下降，是因為在精子優選制備過程中部分精子丟失的緣故。已知精子成熟是精子核高度濃縮、組蛋白被魚精蛋白取代的過程，成熟后的精子其密度較高，因此，在非連續密度梯度離心過程中，正常精子與非成熟精子、畸形精子、不活動精子及精液中的其他細胞成分在運動能力、運動軌跡和浮力密度等方面存在差異，在非連續密度梯度溶液柱中運動的能力也有差異，離心后精液中的各種成分在密度梯度溶液柱中達到平衡，成熟精子因密度最高而沉淀在離心管底部，從而可以有效篩選出分化成熟而形態相對正常、活動力更好的精子。已有文獻報道通過非連續密度梯度離心法體外處理后的精子發生凋亡和壞死的比例明顯降低，有活力的精子平均百分比明顯升高[7]。本研究顯示，弱精子癥患者精液經非連續密度梯度離心法處理后，大量的死亡或 DNA 損傷的精子被去除，從而使分化成熟的正常精子（綠色熒光精子）比例增加，精子DNA 完整率得到顯著提高，結果與Xue等[8]在優化處理畸形精子癥精液標本時所得結果類似。

綜上所述，對于弱精子癥患者精液標本，采用非連續密度梯度法制備精子，不僅能提高精子活力和正常形態精子百分率，還能富集到更多DNA完整的精子，有效提高制備后精子的DNA完整率，為后續實施人類輔助生殖技術提供安全保障。

參考文獻

1 WHO主編.國家人口和計劃生育委員會科學技術研究所譯.人類精液檢查與處理實驗室手冊.北京: 人民衛生出版社, 2011: 135-139

2 熊承良, 吳明章, 劉繼紅, 等主編.人類精子學.武漢: 湖北科學技術出版社, 2002: 548

3 Mortimer D.Laboratory standards in routine clinical andrology.Reprod Med Rev1994; 3(3): 97-111

4 Morshedi M, Duran HE, Taylor S,et al.Efficacy and pregnancy outcome of two methods of semen preparation for intrauterine insemination: a prospective randomized study.Fertil Steril2003; 79 suppl 3: 1625-1632

5 王新生, 孟凡會, 劉海寧, 等.精液體外處理對精子核DNA鏈完整性影響的研究.中國男科學雜志 2004;18(4): 22-24

6 Bungum M, Humaidan P, Axmon A, et al.Sperm DNA integrity assessment in prediction of assisted reproduction technology outcome.Hum Reprod2007; 22(1): 174-179

7 徐鴻毅, 羅清炳, 鄧凱, 等.密度梯度離心后精子懸液中彈性硬蛋白酶濃度和精子DNA完整性的測定.中國優生與遺傳雜志 2015; 23(2): 94-95, 127

8 Xue X, Wang WS, Shi JZ,et al.Efficacy of swim-up versus density gradient centrifugation in improving sperm deformity rate and DNA fragmentation index in semen samples from teratozoospermic patients.J Assist Reprod Genet2014; 31(9): 1161-1166