血清miRNA-107檢測在前列腺癌診斷與預后判斷中的價值

羅振國 鄧勇泉 陳向鋒 遲寶進 陶 然 王 凱

1.佳木斯大學附屬第一醫院泌尿外科（黑龍江佳木斯 154003）；2.上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院泌尿外科

外周血miRNA作為腫瘤標志物在乳腺癌、肺癌、結直腸癌、前列腺癌等研究中已經取得一定的成果[1,2]。本研究采用實時熒光定量PCR檢測前列腺癌（PCa）患者和前列腺增生（BPH）患者血清miRNA-107的表達水平，研究其對前列腺癌診斷與預后的價值，并分析其與 PCa臨床病理參數的相關性。

材料和方法

一、臨床資料

收集2015年10月至2017年10月期間在我院泌尿外科經病理活檢確診的 PCa 和 BPH 患者術前血清。其中PCa患者30例，年齡62～91歲，平均年齡為（77.8±7.4）歲；BPH 患者30例，年齡63～88歲，平均年齡（75.3±6.0）歲。所有患者術前未行任何治療。對可能影響miRNA表達的慢性疾病患者不納入本次研究。病理分級依據 2003年WHO前列腺癌病理組織學分類標準Gleason評分，腫瘤分期按AJCC的TNM系統。兩組研究對象年齡的差異均無統計學意義（P＞0.05）。采集標本前獲得患者知情同意和我院倫理委員會批準，所有的血清標本保存在-80℃。PSA檢測由我院檢驗科完成。

二、方法

1. RNA提?。喝』颊哐?00μL，用 mir VanaTPAISTMmiRNA 試劑盒（Applied Biosystems）提取總RNA。按照ABI公司miRNA提取試劑盒分離提取miRNA，嚴格按照試劑盒說明方法步驟進行逆轉錄。

2.實時熒光定量PCR檢測（qRT-PCR）：以總RNA 5μL為模板，應用Taq Man MicroRNA Reverse Transcription 試劑盒（ABI）進行反轉錄，總反應體系為15μL，反應條件如下：16℃30min，42℃ 30min，85℃5min，反轉錄引物miRNA-107特異性的莖環引物（Taq ManMicroRNA Assay ABI），其中上游序列為:5'-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA-3'，下游序列:3'-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-5'；內參基因上游序列:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，下 游 序 列: 3'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-5'，miRNA-107反轉錄引物、PCR引物和探針分別來自ABI生物公司TaqMan MiRNA RT Kit和TaqMan MiRNA Assay Kit。熒光定量PCR總反應體系為20μL，反應條件為：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環。所有反應均在ABI 7500實時定量PCR儀上完成，每個樣本重復3次，以U6為內參基因。采用 2-ΔCt計算 miRNA-107的相對定量表達水平，其中 ΔCt = CtmiRNA-107-CtU6。

3.統計學處理：應用 SPSS 17.0 統計軟件分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用兩獨立樣t檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA分析和 LSD-t檢驗。用SPSS 17.0 軟件繪制ROC曲線。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、miRNA-107在前列腺癌、良性前列腺增生患者血清中的表達水平

PCa、BPH患者血清 miRNA-107的相對表達水平見圖1，PCa 組miRNA-107表達水平（15.19±4.44）較BPH組（9.66±3.97）增加明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 miRNA-107在前列腺癌組及前列腺增生組中的表達

二、ROC 曲線分析

miRNA-107對前列腺癌的診斷價值用 SPSS 17.0軟件構建ROC曲線顯示miRNA-107能夠較好地區分前列腺癌與BPH，見圖2，ROC曲線顯示，miRNA-107區分前列腺癌和BPH的ROC曲線下面積（AUC）為0.806（曲線A），95%置信區間為（0.698～0.913），敏感度和特異性分別為66.7%和83.3%；PSA聯合miRNA-107區分PCa和BPH的ROC曲線下面積為0.912（曲線B），95%置信區間為（0.839～0.985），敏感度和特異性分別為80.0%和86.7%。

圖2 ROC曲線

三、miRNA-107表達水平與 PCa 臨床特征的相關性

miRNA-107的表達水平與PCa患者的年齡差異無統計學意義（P＞0.05），Gleason 評分≥8分組與＜8分組miRNA-107的表達量分別為17.05±3.61和10.86±2.96，差異有統計學意義（P＜0.01）。血清miRNA-107表達水平與臨床分期相關，隨著臨床分期的增加，miRNA-107的表達水平增加，差異具統計學意義（P＜0.01）。此外，骨轉移的PCa miRNA-107表達量與未轉移者相比增加，差異有統計學意義（P＜0.05），miRNA-107表達量與血清PSA水平顯著相關（P＜0.05），見表1。

討 論

miRNA是一類非編碼、長度約為18～25nt的單鏈小RNA，miRNA參與細胞重要的生理病理變化過程，并且在研究中發現許多惡性腫瘤中都觀察到miRNA的異常[2]。Lawrie 等[3]第一個證實表明血清中存在腫瘤特異性miRNA，他們發現彌漫性大B細胞淋巴瘤患者的血清中miRNA-21表達量明顯高于正常對照組，并且miRNA-21的表達水平與患者的生存率相關。近來Chen等[4]發現血漿microRNA表達譜可作為PCa非侵入性的標志物，并且let-7c、let-7e、miRNA-30c、miRNA-622和miRNA-1285等5個miRNAs 能夠準確地區分PCa和BPH（AUC=0.924）。Chen等研究[5]顯示miRNA-107通過抑制let-7 家族促進腫瘤的生長，起“癌基因”的作用。近期，Bryant等[6]應用qRT-PCR分析了PCa患者與正常對照血漿miRNA，篩選出12種異常表達的miRNA，其中miRNA-107在PCa中明顯高表達（AUC＝0.62），并且在PCa患者尿液中也發現了高表達的miRNA-107。本研究通過qRTPCR檢測PCa、BPH 血清中miRNA-107的相對表達水平，發現miRNA-107在PCa中高表達，能較好地區分PCa、BPH，AUC為0.806,與Bryant等[6]研究結果相一致。PSA聯合miRNA-107區分Pca和BPH的AUC為0.912,敏感度和特異性分別為80.0% 和86.7% 。

表1 前列腺癌miRNA-107表達量與臨床特征的相關性（±s）

表1 前列腺癌miRNA-107表達量與臨床特征的相關性（±s）

臨床特征 n miRNA-107的表達( 2- ΔCt×10-4)量統計量 P值年齡(歲)≤70 5 14.30±2.11 t＝0.483 ＞0.05＞70 25 15.37±4.79臨床分級T1 4 8.00±1.20 F＝52.01 ＜0.01 T2 6 12.36±0.64 T3 11 15.17±1.62 T4 9 20.31±2.49 Gleason評分＜8 9 10.86±2.96 t＝4.524 ＜0.01≥8 21 17.05±3.61骨轉移是6 19.46±2.35 t＝2.963 ＜0.05否24 14.12±4.21 PSA ρB (ng?mL-1)≤10 8 10.41±3.23 t＝4.015 ＜0.05＞10 22 16.65±3.70

本研究還發現 PCa 患者血清miRNA-107水平與Gleason評分相關，Gleason評分＞8的 PCa 患者血清miRNA-107水平明顯增加；此外miRNA-107的表達水平隨著臨床分期的增加而增加；并且骨轉移的PCa患者血清miRNA-107顯著高于未轉移者。Bryant等[6]發現轉移性PCa與miRNA-107水平相關，轉移性PCa miRNA-107水平高于未轉移者。Brase等[7]表明miRNA-107 是高風險腫瘤的標志物，循環miRNA-107水平與 Gleason評分相關。上述研究結果提示，血清miRNA-107可作為PCa診斷和預后的分子標志。近年來發現循環miRNA不僅可作為腫瘤診斷和預后判斷的標志物，還可以作為個性化治療的一種潛在方法[8]。經直腸超聲引導下穿刺活檢是我國PCa診斷的金標準[9]，隨著PSA在臨床上的廣泛應用，PCa的診斷及治療技術不斷完善，PCa的綜合治療趨于成熟，但是25%～50%的患者仍然面臨著生化復發問題，即術后PSA水平的升高[10]。我國逐步邁入老齡化社會，人均壽命的不斷增長，生活習慣及飲食結構的不斷改變，PCa發病率不斷攀升，此外中老年男性缺乏泌尿外科相關的科普知識，出現排尿梗阻等不適癥狀時往往未及時就診，我國PCa患者確診時多屬晚期，常常導致預后差、死亡率高的現狀，因此對于中老年男性應提倡PCa的早期篩查。PSA聯合檢測血清miRNA-107對于PCa的臨床診斷意義重大，可以增加前列腺穿刺活檢的陽性率，避免不必要的前列腺穿刺等，但仍需后續的相關實驗研究。根據miRNA-107的具體含量來輔助評定臨床中診斷證據不足或者難以診斷的患者是否可行PCa的相關治療，完成PCa的早發現、早診斷、早治療，對提高患者治愈率和預后生活水平有重要意義。

綜上所述，PCa患者血清中可以檢測到miRNA-107高表達，可以作為PCa的早期診斷及評定預后的標記物之一，聯合PSA檢測的結果，對于PCa的臨床早期診斷具有協同作用，或許對PSA水平增高但穿刺活檢為陰性的患者有特殊的意義，但相關數據仍需進一步的實驗加以驗證。由于本研究樣本量偏小，會產生偏倚，需進一步擴大樣本量及多中心的患者群體中進一步驗證，為PCa的早期診斷、療效判斷及預后分析提供有力武器。

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