慢病毒介導的miR194-5p過表達精原細胞株的建立*

夏 靜 夏蒙蒙 牛長敏 申雪沂 王建軍 鄭 英

揚州大學醫學院組織學與胚胎學教研室（江蘇揚州 225001）

miRNA是一類長約18-22nt的小分子非編碼RNA，它們能結合在多個下游靶基因的3′UTR（3’端非編碼區），通常導致靶基因的表達沉默，進而在一系列生物學過程中發揮重要功能[1]。研究表明miRNA也參與精子發生過程的調控，且有表達細胞特異性及階段性[2]。一些特異性的miRNA能作為診斷男性不育的潛在標記[3,4]。Stra8（stimulated by retinoic acid 8）對精子發生具有重要意義，其對減數分裂的啟動是必須的，同時它對精原細胞的分化也發揮著重要的作用，但是其調控精子發生的機制尚不清楚。miRNA是否能通過Stra8調控精子發生過程尚不清楚。利用生物信息學分析方法，我們發現Stra8是miR-194-5p下游靶基因之一，因此我們試圖探討miR-194-5p與Stra8之間是否具有調控關系。本研究旨在構建攜帶miR-194-5p的慢病毒表達載體，并包裝成慢病毒，以期達到高效穩定感染目的細胞Stra8-GC1-spg，建立穩定表達miR-194-5p的精原細胞株，為深入研究miR-194-5p與Stra8之間的調控關系及闡明Stra8在精子發生中的作用機制提供參考價值。

材料和方法

一、材料

慢病毒表達質粒pMSCV-PIG及Gag pol、VSV.G輔助質粒由江蘇省非編碼RNA基礎與臨床轉化重點實驗室郁多男教授惠贈。LA tag酶、EcoRⅠ BglⅡ、miRNA逆轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。pGEM-T-easy 載體、T4 DNA連接酶、切膠回收試劑盒購自Promega公司。293T細胞、Stra8-GC1-spg、大腸桿菌JM109由本實驗室前期保存。DMEM、FBS購自Hyclone公司；X-gal和IPTG、嘌呤霉素、PEI購自北京索萊寶生物有限公司；核酸提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司；引物合成及DNA測序由深圳華大基因生物工程公司完成。

二、方法

（一）目的片段的擴增

利用小鼠基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，PCR擴增引物：F：5′-GGAGATCTCCACCA CACACCAGGAAGAG-3′，R: 5′-GGGAATTCT AACCAAGAGCCCACCCAG-3′；PCR反應體系：ddH2O 31.5μL，LA buffer 5μL，2.5mMdNTPs 8μL，F(10μM)2μL，R（10μM）2μL，LA tag酶0.5μL，DNA 1μL；PCR反應條件：95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共35個循環，72℃ 5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

（二）pGEM-T-easy-miR194-5p重組質粒的構建

PCR產物經AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進行純化，后與pGEM-T-easy 載體連接，連接產物轉化到JM109感受態中，涂于LB瓊脂糖平板（含50μg /μL X-gal和0.1moL IPTG、50μg /mL氨芐青霉素）上。37℃孵育過夜，經藍白斑篩選，取白色克隆,搖菌過夜，堿裂解法提取質粒，EcoRⅠ酶切鑒定，最后進行DNA序列測定驗證。

（三）pMSCV-PIG-miR194-5p重組載體構建

將pGEM-T-easy-miR194-5p及慢病毒載體pMSCV-PIG分別進行EcoRⅠ、BglⅡ雙酶切，回收并純化所需片段，以載體插入片段=1:3～1:5摩爾比進行連接，轉化JM109感受態菌后涂于LB瓊脂糖平板（含50μg /mL氨芐青霉素）上，37℃過夜。次日，挑單菌落接種于LB培養液（50μg /mL氨芐青霉素）中，37℃振搖培養過夜,用堿裂解法提取質粒，利用EcoRⅠ、BglⅡ雙酶切鑒定。

（四）慢病毒包裝

將293T細胞鋪于6cm細胞培養皿內，使次日細胞融合率為60%左右。每孔加3mL DMEM完全培養基。慢病毒包裝轉染體系：0.9%NaCl 500μL、Gag pol 3μg 、VSV.G 3μg、pMSCV-PIG-miR194-5p 8μg（實驗組）或pMSCV-PIG 8μg（對照組）、PEI 100μL（μg/μL），混勻后室溫孵育10min，加至培養的293T細胞中，37℃、5%CO2過夜，12h后更換為DMEM完全培養基。分別收集轉染后36h、48h、60h、72h的病毒上清，經0.45μm濾器過濾，-80℃保存。

（五）慢病毒感染效果的驗證

將293T細胞鋪于6cm細胞培養皿內，使次日細胞融合率為60%左右。按照以下體系感染293T細胞：慢病毒上清 2mL、enhance 液1mL、polybrene 1.5μL，37℃、5%CO2培養箱培養。6h后進行重復感染一次。6h后再進行第三次感染。6h后更換為新鮮的DMEM完全培養基。72h后用倒置熒光顯微鏡觀察感染的293T細胞有無綠色熒光。分別提取pMSCV-PIG-miR194-5p感染組及 pMSCV-PIG對照組293T細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，qRTPCR驗證感染慢病毒的293T細胞內的miR194-5p轉錄水平。

（六）穩定過表達miR194-5p Stra8-GC1-spg細胞株的建立

將Stra8-GC1-spg細胞鋪于六孔板內，使次日細胞融合率為50%左右。在六孔板每孔內加入enhance液0.5mL、慢病毒上清1.5mL 、polybrene1μL。37℃、5%CO2培養箱培養。6h后進行重復感染一次。6h后再進行第三次感染。6h后更換為新鮮的DMEM完全培養基。72h后用倒置熒光顯微鏡觀察細胞是否帶有綠色熒光。用5μg/mL嘌呤霉素篩選一周，以獲得穩定過表達miR194-5p Stra8-GC1-spg細胞株。

（七）miR194-5p表達水平的驗證

分別取感染慢病毒pMSCV-PIG-miR194-5p及對照組pMSCV-PIG的Stra8GC1細胞，用TRIzol提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書步驟進行反轉錄，以此cDNA為模板，應用實時定量PCR法檢測miR194-5p的表達水平，并用2-ΔΔct計算其相對表達量，兩組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

結 果

一、目的基因片段pri-miR194-5p的擴增

以小鼠基因組DNA為模板，進行PCR反應擴增，獲得目的基因片段pri-miR194-5p，其大小為293bp，與預計片段大小相一致（圖1）。

圖1 pri-miR194-5p PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

二、pri-miR194-5p與pGEM-T-easy 載體的連接

將pri-miR194-5p PCR產物與pGEM-T-easy載體相連接，經酶切鑒定證實PCR片段已成功插入到pGEMT-easy載體（圖2）。DNA序列測定證實此序列與pri-miR194-5p序列完全一致。表明pGEM-T-easy-primiR194-5p重組載體構建成功。

三、pMSCV-PIG-miR194-5p重組載體的構建

將重組質粒pGEM-T-easy-pri-miR194-5p及空載慢病毒載體pMSCV-PIG分別進行雙酶切,然后進行連接，獲得的重組質粒pMSCV-PIG-miR194-5p經限制性內切酶酶切鑒定,發現重組質粒pMSCV-PIG-miR194-5p構建成功（圖3）。

四、慢病毒的包裝及表達的驗證

圖2 pGEM-T-easy-pri-miR194-5p酶切鑒定產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 pMSCV-PIG-miR194-5p酶切鑒定

圖4 pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p重組質粒轉染293T細胞72h后熒光圖

圖5 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染293T細胞72h后熒光圖

應用PEI法轉染293T包裝細胞，72h后熒光顯微鏡觀察發現大多數293T細胞均顯示綠色熒光（圖4）。用慢病毒上清感染293T細胞，72h后熒光顯微鏡觀察，發現大部分293T細胞顯示綠色熒光（圖5）。表明包裝的慢病毒顆粒能成功感染細胞。應用實時定量PCR對感染后的293T細胞進行miR194-5p表達水平檢測，結果發現，與對照組相比較，實驗組細胞表達高水平miR194-5p（圖6）。提示慢病毒能有效感染293T細胞并高表達miR194-5p。

五、過表達miR194-5p Stra8-GC1-spg細胞株的建立

應用慢病毒上清感染Stra8-GC1-spg。72h后熒光顯微鏡觀察，發現細胞有綠色熒光產生（圖7）。經嘌呤霉素篩選1周后，對miR194-5p表達水平進行定量分析。結果發現與對照組相比較，實驗組Stra8-GC1-spg細胞中miR194-5p的表達量明顯增高（圖8），表明成功穩定過表達miR194-5p Stra8-GC1-spg細胞株。

圖6 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的293T細胞中miR194-5p相對表達水平分析

圖7 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染Stra8-GC1-spg細胞72h后熒光圖

圖8 慢病毒pMSCV-PIG及pMSCV-PIG-miR194-5p感染的Stra8-GC1-spg細胞中miR194-5p的相對表達水平分析

討 論

精子發生是高度精密的過程，此期間需要大量的基因在轉錄、轉錄后及表觀遺傳學水平對其進行調控。大量研究發現在精子發生的不同階段，miRNAs作為轉錄后調控元件，可能通過激活特異性基因的表達參與精子發生[5]。在人類精子發生中，miRNAs也發揮著重要的功能[6,7]。 研究發現在小鼠精子發生中一些miRNAs（miR-221, miR-203, miR-34b-5p）特異性表達于精原干細胞、減數分裂前細胞及減數分裂細胞中[8]。 miR-34c特異性表達在睪丸內，且主要表達在減數分裂晚期的粗線期精母細胞及精子細胞中[9]。 miR-449a 及miR-34b/c在鼠科精子發生中有協同作用[10]。miR-146能作用在靶基因Med1上進而阻礙視磺酸誘導精原細胞分化[11]。 另外，miR-221/222家族通過作用在Kit mRNA 上，進而維持未分化精原細胞數量[12]。

目前已知Stra8作為精子發生中一個基因，對精原細胞的分裂分化及減數分裂的啟動都發揮著重要的作用。研究發現Stra8基因敲除的雄性小鼠不育[13]。但是關于Stra8在精子發生中的作用機制目前仍未能完全闡明。Yu等發現miR-34c可能通過作用在Nanos2的3’UTR上抑制其表達，而這將導致Stra8 、Scp3及 Dazl的表達上調，而促進減數分裂進程[14]。Wang等發現在雞的睪丸內miR-31 可以通過作用在靶基因Stra8的3’UTR（非編碼區）上直接抑制Stra8的表達進而阻滯減數分裂的進程[15]。而有關miRNAs與Stra8之間的關系目前仍未完全闡明。信息學分析發現mmu-miR-194-5p是Stra8上游的靶向miRNA。而目前有關miR-194-5p的研究僅僅是著重在它在各種腫瘤及免疫性疾病上的作用[16-19]。而有關miR-194-5p與Stra8之間的調控關系及它們在精子發生中的作用目前仍未有任何報道。是否有可能miR-194-5p可以在精子發生的特定階段被激活，從而發揮對Stra8的調控作用呢？因此研究miR-194-5p與Stra8之間的關系對揭示Stra8在精子發生中的作用機制具有十分重要的意義。

本實驗室前期工作中已構建了Stra8過表達精原細胞株，將其命名為Stra8-GC1-spg。為了進一步研究miR194-5p與Stra8之間的調控關系，本研究采用了慢病毒重組質粒pMSCV-PIG-miR194-5p來包裝293T細胞，產生慢病毒顆粒。為了檢測該慢病毒是否包裝成功，我們將獲得的病毒上清首先感染了293T細胞，通過熒光實時定量發現與對照組相比，pMSCV-PIG-miR194-5p慢病毒感染組，miR194-5p表達水平明顯增高。說明該慢病毒已經包裝成功。本實驗中所用的pMSCV-PIG空載質粒帶有GFP標簽，能使細胞產生綠色熒光。轉染293T時使用的PEI(Polyethylenimine)是一種聚合物轉染試劑，它是運用最廣泛及最有效的非病毒載體之一[20]。PEI每相隔二個碳原子就有1個氨基，構成了多聚網狀結構，它具有大量的正電荷，能使 DNA 縮合成顆粒狀。PEI/DNA 復合物通過靜電作用吸附到細胞表面，經過細胞內吞作用進入細胞內[21]。PEI 幾乎可在任何 pH 條件下都能夠吸收質子，這使其具有質子海綿的作用[22]。這一特性使 PEI能在內涵體的酸性環境中吸收 H+，進而增高內涵體內的滲透壓，導致膜不穩定甚至破裂，從而使PEI/DNA復合物從內涵體內逃逸出來，避免 DNA 降解。一般認為，PEI 的基因轉染效率隨其相對分子質量的增大而提高。這是由于 PEI 相對分子質量越大，其質子海綿作用越強，PEI/DNA 復合物就更快的被釋放入胞質，從而減少了內涵體對 DNA 的降解，進而提高了轉染效率[23]。重要的是PEI以鹽酸鹽形式提供，大大提高了水溶性。與Lipofectamine 2000相比，PEI轉染效率更高，且細胞凋亡率更低[24]。我們用該慢病毒感染Stra8-GC1-spg細胞72h后，嘌呤霉素篩選獲得穩定表達miR194-5p的Stra8-GC1-spg細胞株。通過熒光實時定量分析發現miR194-5p 在Stra8-GC1-spg細胞中miR194-5p的表達水平與對照組相比顯著性增高。當我們應用瞬時轉染法轉染精原細胞株時轉染效率很低，但用此方法包裝出的慢病毒感染Stra8-GC1-spg細胞使感染效率大大提高，因而更加有利于后續實驗的開展。本研究采用的慢病毒系統優于一般的商品化的慢病毒感染系統，既具有GFP熒光示蹤系統，又能夠通過嘌呤霉素進行陽性細胞的篩選。

總之，本實驗成功構建了過表達miR194-5p 的Stra8-GC1-spg細胞株。這種細胞系可以作為一種細胞模型用于后續研究miR194-5p與Stra8之間的調控關系，為進一步揭示Stra8在精子發生中的作用機制奠定基礎。

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