FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2在乳腺癌中的表達及臨床意義

劉 靜，周炳娟，馬秋雙，陳 紅，張金庫

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅著女性的健康和生命。目前，有關乳腺癌發生、發展機制、生物學行為、預后指標及靶向治療方法等方面的研究是醫學界廣泛關注的熱點。本研究采用免疫組織化學的方法檢測叉頭框轉錄因子M1(FOXM1)、Polo樣激酶1(PLK1)、缺氧誘導因子1α(HIF-1α)及果蠅Zeste基因增強子人類同源物2(EZH2)在乳腺浸潤性導管癌組織中的表達情況及其與乳腺癌臨床病理指標間的關系，以期為乳腺癌的臨床治療和預后判斷提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2005-01至2014-10河北省保定市第一中心醫院病理科確診的乳腺浸潤性導管癌石蠟標本，選取有完整臨床病理資料的803例，癌旁乳腺組織(距腫瘤邊緣5 cm的乳腺組織) 作為對照。患者均為女性，年齡24～79歲，平均(51.0±1.8)歲。組織學分級Ⅰ級164例，Ⅱ級361例，Ⅲ級278例。有淋巴結轉移的348例，無淋巴結轉移的455例；Ⅰ～Ⅱ期678例，Ⅲ～Ⅳ期125例。乳腺癌患者術前均未行放療、化療及內分泌治療。

1.2 免疫組化 兔抗人FOXM1多克隆抗體、兔抗人PLK1單克隆抗體、HIF-1α多克隆抗體購自美國Abcam公司、兔抗人 EZH2 單克隆抗體購自美國CST公司，采用MaxVision兩步法染色，具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。PBS代替一抗設為陰性對照；以已知FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2陽性的胃癌組織設為陽性對照。

1.3 染色結果判定 Fox1M1、PLK1和HIF-1α蛋白陽性染色主要為細胞核和(或)細胞質出現棕黃色顆粒；EZH2蛋白陽性染色主要為細胞核出現棕黃色顆粒，少量胞質出現棕黃色顆粒。在高倍鏡下隨機選取5個高倍視野(× 400)，每個視野計數 200個細胞，共計1000個，觀察染色強度并計算每張切片陽性細胞百分率[1-4]。

1.4 統計學處理 采用IBM SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，多個樣本率的兩兩比較采用卡方分割法，相關性分析采用Spearman相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白的表達情況 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在乳腺浸潤性導管癌組中的陽性表達率顯著高于其在癌旁乳腺組織中的表達，差異具有統計學意義(圖1，表1)。

圖1 FOXM1、PLK1、HIF-1α、EZH2在乳腺癌組織中的表達(IHC×200) A. FOXM1；B. PLK1；C. HIF-1α；D. EZH2 表1 乳腺浸潤性導管癌患者FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在各組中的表達 (n；%)

2.2 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白與乳腺癌臨床病理特征間的關系 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白的表達與乳腺癌組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期密切相關，而與患者年齡、是否絕經及腫瘤大小無關。PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白的表達與ER負相關，FOXM1和EZH2蛋白的表達與HER-2正相關(P<0.01，表2)。

2.3 FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白在乳腺浸潤性導管癌中表達的相關性分析 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2蛋白在乳腺浸潤性導管癌中的表達呈正相關關系(表3)。

表2 FOXM1、PLK1、HIF-1α和EZH2與乳腺癌臨床病理指標間的關系 (n；%)

注：與組織學Ⅰ級比較，①P<0.001；與組織學Ⅱ級比較，②P<0.001。與有淋巴結轉移比較，③P<0.001。與Ⅲ～Ⅳ期比較， ④P<0.001。與ER陰性比較，⑤P<0.001。與HER-2陰性比較，⑥P<0.001

表3 乳腺癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2表達的相關性

3 討 論

FOXM1是叉頭框蛋白家族中的一員，其異常表達能夠促增殖，抗凋亡、參與上皮-間質轉化、活化信號轉導通路，促進腫瘤細胞的轉移等[5，6]。FOXM1在乳腺癌中顯著高表達，而且能夠與ERα相互作用，促進乳腺癌細胞的增殖[7]。同時，作為HER-2下游的靶基因，FOXM1的表達受到HER-2調節從而發揮促進乳腺腫瘤形成的作用[8]。PLK1是polo-like激酶家族的重要成員，控制著有絲分裂的多個階段[9]。研究發現，PLK1在三陰性乳腺癌中表達水平更高，而且PLK1與ERα的表達相關，因此認為PLK1可能是TNBC潛在的治療靶點[2,10]。HIF-1α是廣泛存在于多種細胞的轉錄因子，能夠促進乳腺原發腫瘤的生長、誘導乳腺癌干細胞表型(BCSC表型)，通過增強缺氧乳腺癌細胞的能動性，使癌細胞具有轉移和復發的能力。HIF-1α高表達與無淋巴結轉移乳腺癌患者的無病生存期及總生存期較短有關，并與乳腺癌高復發率、高轉移率及高死亡率有關[11]。EZH2基因定位于人染色體 7q35 的位置上，為表觀遺傳調控因子多梳抑制復合體 2 (polycomb repressivecomplex 2, PRC2) 的催化亞基，可通過其組蛋白甲基轉移酶活性對組蛋白的第27位的賴氨酸進行甲基化，抑制靶基因轉錄，參與多種生理或病理過程。有學者證實，從正常乳腺組織、不典型增生、導管原位癌至浸潤性導管癌，EZH2的表達逐漸增加，而且EZH2高表達與乳腺癌的浸潤及高增殖活性密切相關[12,13]。

本研究發現，與癌旁乳腺組織相比，乳腺浸潤性導管癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白的陽性表達率顯著升高，而且隨著組織學分級增加，FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2的表達也逐漸升高。同時，FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2蛋白在有淋巴結轉移及pTNM分期Ⅲ-Ⅳ期組乳腺癌組織中的表達顯著高于無淋巴結轉移及pTNM分期Ⅰ～Ⅱ期組。研究結果進一步提示FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2可能參與了乳腺癌的發生，而且與乳腺癌浸潤、轉移的能力有關，可能成為乳腺癌預后評估重要的指標。同時本實驗結果顯示，PLK1、HIF-1α及EZH2與ER表達呈負相關關系，而與HER-2呈正相關關系，提示三種蛋白過表達可能在ER陰性乳腺癌的癌變過程中發揮更重要的作用。

腫瘤的發生、發展涉及復雜的、相互作用機制。FOXM1通過周期性上調CCNB1和PLK1在內的一組基因的表達控制著有絲分裂的啟動，而PLK1通過直接的磷酸化作用，調節FOXM1的轉錄，并增強其活性，二者參與形成一個激酶誘導的正反饋鏈[14,15]。缺氧條件下，HIF-1α一方面通過選擇性抑制SUZ12和EED使PRC2失活；另一方面增強了EZH2 與FOXM1的聯合作用，使MMPs表達增加，促進了三陰性乳腺癌的浸潤[16]。同時，EZH2 是 miRNA-101的直接靶分子，在前列腺癌細胞中，HIF-1α通過抑制miRNA-101促進EZH2蛋白的表達。VEGF/ VEGFR2信號通路可通過影響E2F、miR-101、HIF-1α等分子，調節EZH2表達。VEGF促進HIF1α活性，增加肺癌中EZH2表達水平，降低肺癌中VEGF水平，能夠抑制EZH2表達，影響肺癌的生物學進程[17-19]。本研究顯示，乳腺浸潤性導管癌中FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2的表達具有正相關關系，提示乳腺腫瘤形成過程中四種蛋白可能發揮了協同作用，促進了乳腺癌的發生、發展、浸潤和轉移，可能成為評估乳腺癌患者預后的重要指標。同時，深入研究FOXM1、PLK1、HIF-1α及EZH2上下游分子及靶基因的功能，將為探索靶向治療策略提供理論支持。

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