大腸癌組織miR-143-3p表達變化與患者臨床病理參數和多藥耐藥的關系

杜夢楠，嚴曉麗，袁亞男，黃艷潔，鄭紀寧

(承德醫學院，河北承德067000)

根治性手術后輔以化療是目前大腸癌的主要治療手段，多藥耐藥(MDR)是導致化療效果不佳的主要原因。MDR的發生可能涉及多種基因的改變，目前研究最多的是ABC轉運蛋白家族中多藥耐藥蛋白1(MDR1)。MDR1的編碼蛋白P-糖蛋白(P-gp)是一種ATP能量依賴性藥物輸出泵，可將細胞內藥物泵至細胞外，從而降低藥物在細胞內蓄積，導致化療效果降低[1，2]。微小RNA(miRNA)是一類長度約為20個核苷酸序列的非編碼小分子RNA，廣泛存在于多種生物體內，具有調控基因表達功能。miRNA作為內源性小分子RNA幾乎在所有腫瘤組織中異常表達。miR-143位于人類第5號染色體上，根據剪切具有莖環結構的前體部位不同，可加工成miR-143-3p和miR-143-5p，目前的研究多集中在miR-143-5p上。研究證實，miR-143-5p可調控細胞增殖、細胞凋亡及細胞周期等，在多種腫瘤中發揮抑癌基因作用，如前列腺癌[3]。但關于大腸癌組織miR-143-3p表達變化及其與患者臨床病理參數和MDR的關系鮮有報道。本研究觀察了大腸癌組織miR-143-3p表達變化，現分析其表達變化與患者臨床病理參數和MDR的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月～2017年3月在承德醫學院附屬醫院行大腸癌根治術的大腸癌患者50例。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。納入標準：①年齡>18歲；②首次行大腸癌根治術，術前未行任何抗腫瘤治療；③KPS評分>70分，預計生存期>3個月；④無重要臟器嚴重疾病。排除標準：①非原發性大腸癌；②存在其他部位腫瘤；③術前接受抗腫瘤治療；④臨床病理資料不完整。其中，男32例、女18例，年齡24～73歲、中位年齡56歲；腫瘤部位：結腸27例，直腸23例；腫瘤形態：潰瘍型24例，隆起型26例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期34例；組織分化程度：高中分化33例，低未分化17例；腫瘤浸潤深度：未浸透漿膜層20例，浸透漿膜層30例；有淋巴結轉移15例，無淋巴結轉移35例。本研究經承德醫學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者或其家屬均知情同意。

1.2 miR-143-3p、MDR1 mRNA表達檢測 采用莖環逆轉錄實時熒光定量PCR法。將手術切除的大腸癌組織50例份及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)30例份，液氮中保存備用。取部分大腸癌組織及癌旁正常組織，置于經DEPC水處理的勻漿器中，加入1 mL TRIzol冰上充分勻漿，常規提取組織總RNA，經NanoDrop2000分光光度計檢測，A260/A280為1.9～2.1，說明提取的總RNA純度合格，可用于后續實驗。取總RNA 2 μg，按照tiangen miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明將其逆轉錄為cDNA，然后進行PCR擴增。所有引物由大連寶生物工程有限公司設計合成。引物序列：MDR1 上游引物 5′-GGAGCCTACTTGGTGGCACATAA-3′，下游引物5′-TGGCATAGTCAGGAGCAA-ATGAA-3-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-TGGTGAAGACGCCA-GT-3′；miR-143-3p莖環引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGAGC-TA-3′，上游引物5′-CGAGAGTGAGATGCACTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGCGAGG-3′；U6莖環引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC-GCACTGGATACGACAAAATA-3′，上游引物5′-AGA-GAAGATTAGCATGGACCCTG-3′，下游引物5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。熒光定量PCR采用SYBR Green法，試劑盒為北京天根生化科技有限公司的 SuperReal PreMix Plus。反應體系共20 μL：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free ddH2O補足至20 μL；反應條件：95 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s共40個循環。檢測miR-143-3p mRNA表達時，以U6為內參；檢測MDR1 mRNA表達時，以GAPDH為內參。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復3次，取平均值。分析大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達與MDR1 mRNA表達的關系，以及大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達與患者臨床病理參數的關系。

2 結果

2.1 大腸癌組織與癌旁正常組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達比較 大腸癌組織與癌旁正常組織miR-143-3p mRNA相對表達量分別為0.36±0.22、1.48±0.43，MDR1 mRNA相對表達量分別為5.84±0.26、1.09±0.38，二者比較P均<0.05。

2.2 大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達與MDR1 mRNA表達的關系 Spearman相關分析顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對表達量與MDR1 mRNA相對表達量呈負相關關系(r=-0.467，P<0.01)。

2.3 大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

3 討論

腫瘤MDR是指一種藥物作用于腫瘤使之產生耐藥性后，該腫瘤對未接觸過、結構無關、機制各異的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性[4]。目前關于大腸癌MDR的機制尚不清楚。

表1 大腸癌組織miR-143-3p、MDR1 mRNA表達與患者臨床病理參數的關系

miRNA是一類非編碼小分子RNA，目前已發現2 000多種，在已發現的人類miRNA中，約50%與腫瘤有關[5]。成熟的miRNA可通過與RNA誘導沉默復合物(RISC)結合形成RISC復合物，后者可特異性識別靶mRNA的3′非編碼區，從而引起靶mRNA降解、翻譯抑制等，在轉錄后水平調控一個或多個基因表達。研究發現，多種miRNA與大腸癌的發生、發展有關，如miR-31、miR-126、miR-552等[6，7]；miR-143在多種腫瘤細胞中低表達，如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌等[8]；miR-143能促進口腔鱗癌細胞增殖并抑制其凋亡，在口腔鱗癌的發生、發展過程中可能具有抑癌基因作用[9]；miR-143可能通過激活caspase-3、caspase-8、caspase-9下調細胞外調節蛋白激酶、核因子κB和bcl-2表達，促進細胞凋亡[10]。也有研究認為，miR-143可能直接作用于kras、elk1、myo6等與腫瘤發病相關的基因[11]。馮麗萍等[12]研究發現，miR-143通過靶向作用于EGFR/RAS/MAPK信號通路，抑制前列腺癌細胞增殖和遷移，同時增加對多烯紫杉醇的敏感性。以上研究說明，miR-143可能作為抑癌基因參與大腸癌的發生、發展。miR-143有miR-143-3p、miR-143-5p兩種形式，目前的研究多集中在miR-143-5p上，對miR-143-3p的研究相對較少。

MDR1的編碼蛋白P-gp是目前研究最多的、與MDR相關的蛋白。P-gp是ABC家族中的一種跨膜糖蛋白，分子量約為170 kD，可通過ATP的水解獲得能量，將化療藥物泵出細胞外，從而使患者產生耐藥性，繼而降低化療效果[13，14]。有研究顯示，下調miR-27a表達能顯著降低MDR1表達，降低細胞周期蛋白Cyclin D1的轉錄活性，上調P21表達，從而抑制胃癌細胞增殖并逆轉化療耐藥[15]。Wu等[16]研究發現，miR-129-5p通過直接抑制MDR相關的ABC轉運蛋白表達，逆轉胃癌細胞MDR產生。另有研究發現，過表達miR-200c通過下調P-gp或通過抑制JNK通路來抑制腫瘤MDR[17]。但目前對miR-143-3p表達與大腸癌MDR的關系尚不清楚。

本研究結果顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對表達量明顯低于癌旁正常組織，MDR1 mRNA相對表達量明顯高于癌旁正常組織；相關分析顯示，大腸癌組織miR-143-3p mRNA相對表達量與MDR1 mRNA相對表達量呈負相關關系；大腸癌組織miR-143-3p mRNA表達與腫瘤TNM分期、組織分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移有關，而MDR1 mRNA表達與腫瘤組織分化程度、浸潤深度和淋巴結轉移有關。表明miR-143-3p可參與大腸癌的發生、發展，并與MDR有關。但由于本研究樣本量較少，且僅從組織水平進行驗證，其結論準確性有待于進一步證實，后續將擴大樣本量并從細胞水平上進行驗證。

綜上所述，大腸癌組織miR-143-3p低表達，其表達變化與腫瘤進展及MDR有關。目前miRNA與大腸癌MDR的研究尚處于起步階段，其具體機制尚不清楚，還需進一步研究。

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