結直腸癌組織LASP1、MMP-9表達變化及其與患者臨床病理參數的關系

薛松，張磊，單長鳳，吳正升

(1 淮南市第一人民醫院，安徽淮南232007；2 安徽醫科大學病理學教研室)

目前對結直腸癌侵襲和轉移的機制尚不完全清楚，普遍認為是多個基因共同參與的結果[1～3]。LIM和SH3蛋白1(LASP1)是一個近年發現的與腫瘤侵襲和轉移相關蛋白，其在肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中過表達，并與腫瘤的發生、發展密切相關[4]?；|金屬蛋白酶9(MMP-9)是MMP家族中的重要成員，可通過降解基底膜和細胞外基質中的Ⅳ型膠原，促進腫瘤侵襲和轉移；還可促進內皮細胞遷移，加快新生血管形成，進一步促進腫瘤進展[5，6]。目前國內關于LASP1、MMP-9在結直腸癌侵襲和轉移中作用的研究較少。本研究觀察了結直腸癌組織LASP1、MMP-9蛋白表達變化，現分析二者表達的關系及其與患者臨床病理參數的關系，旨在探討其在結直腸癌侵襲和轉移過程中的作用?，F分析結果并報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2016年12月淮南市第一人民醫院收治的結直腸癌患者70例，男40例、女30例，年齡(64.71±9.52)歲。術前均未行任何抗腫瘤治療，術后經組織病理檢查明確診斷。腫瘤直徑：≤5 cm 58例，>5 cm 12例；組織分化程度：高分化7例，中分化54例，低分化9例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴結轉移25例，無淋巴結轉移45例。本研究經淮南市第一人民醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 LASP1、MMP-9表達檢測 采用免疫組化EnVision兩步法。取手術切除的結直腸癌組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。切片常規脫蠟至水，3% H2O2去離子水孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶；蒸鍋中加熱0.01 mol枸櫞酸緩沖液至95 ℃，放入切片水浴15～20 min，自然冷卻至室溫；10%山羊血清封閉，分別加入LASP1(1∶500)、MMP-9(1∶200)一抗，4 ℃孵育過夜；次日加入二抗和辣根酶標記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復染，樹脂封固，顯微鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。①LASP1陽性表達判定：LASP1陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機選取10個200倍視野，每個視野計數200個細胞，觀察細胞染色強度，計算陽性細胞所占比例。細胞染色強度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例：無陽性細胞為0分，≤10%為1分，>10%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。染色強度和陽性細胞所占比例得分乘積≥2分為LASP1陽性表達[7]。②MMP-9陽性表達判定：MMP-9陽性表達定位于細胞質，呈棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機選取10個200倍視野，每個視野計數200個細胞，觀察細胞染色強度，計算陽性細胞所占比例。細胞染色強度：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞所占比例：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。細胞染色強度和陽性細胞所占比例得分相加≥2分MMP-9陽性表達[6]。所有切片由2名病理科醫師盲法獨立閱片，結果不一致時協商判定。

1.3 結直腸癌組織LASP1、MMP-9陽性表達的關系及二者與患者臨床病理參數的關系分析 采用Spearman非參數相關分析法分析結直腸癌組織LASP1陽性表達與MMP-9陽性表達的關系。收集結直腸癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、臨床分期、淋巴結轉移資料，分析LASP1、MMP-9陽性表達與患者臨床病理參數的關系。

1.4 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman非參數相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常組織LASP1、MMP-9陽性表達比較 結直腸癌組織與癌旁正常組織LASP1陽性表達率分別為64.3%(45/70)、35.7%(25/70)，MMP-9陽性表達率分別為58.6%(41/70)、27.1%(19/70)。二者比較P均<0.05。

2.2 結直腸癌組織LASP1陽性表達與MMP-9陽性表達的關系 Spearman非參數相關分析顯示，結直腸癌組織LASP1陽性表達與MMP-9陽性表達呈正相關關系(r=0.664，P<0.01)。

2.3 結直腸癌組織LASP1、MMP-9陽性表達與患者臨床病理參數的關系 見表1。

3 討論

LASP1最初由Christine于1995年首次報道，主要結構域由氨基端的一個LIM(Lin/Is1/Mec)和兩段伴肌動蛋白樣重復序列和羧基端一個scr同源結構域(SH3)組成[8]。LASP1蛋白是LIM蛋白亞家族成員之一，通過LIM結構的介導與細胞膜上突起的肌動蛋白直接發生作用，還可通過SH3區域在細胞偽足形成、延伸及侵襲方面發揮作用[9]。近年研究發現，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等組織中LASP1過表達，其表達變化與腫瘤發生、發展及侵襲、轉移有關[10～12]。本研究結果顯示，結直腸癌組織LASP1陽性表達率明顯高于癌旁正常組織；LASP1陽性表達與腫瘤臨床分期和淋巴結轉移有關，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關。提示LASP1可能參與結直腸癌的侵襲和轉移，與上述報道基本一致。

表1 結直腸癌組織LASP1、MMP-9陽性表達與患者臨床病理參數的關系

細胞外基質和基底膜的降解破壞是腫瘤侵襲和轉移過程中的關鍵步驟之一。MMPs是一組重要的蛋白水解酶家族，通過降解細胞外基質和基底膜成分以及一些非基質成分，改變腫瘤細胞微環境，繼而促進腫瘤侵襲和轉移。MMP-9作為MMPs的一個亞型，除參與降解細胞外基質外，還參與腫瘤新生血管形成及調節細胞黏附等作用，在腫瘤侵襲和轉移過程中發揮重要作用[13]。Tsai等[14]研究發現，在具有侵襲和轉移能力的口腔鱗癌細胞中MMP-9表達明顯升高，說明MMP-9高表達可能與口腔鱗癌的侵襲和轉移有關。本研究結果發現，結直腸癌組織MMP-9陽性表達率明顯高于癌旁正常組織；MMP-9陽性表達與腫瘤臨床分期和淋巴結轉移有關，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無關。提示MMP-9可能參與結直腸癌的侵襲和轉移，與上述報道基本一致。

本研究還發現，結直腸癌組織LASP1陽性表達與MMP-9陽性表達呈正相關關系，說明二者在促進結直腸癌侵襲和轉移過程中可能具有協同作用。

綜上所述，結直腸癌組織LASP1、MMP-9表達升高；二者表達變化可協同促進結直腸癌侵襲和轉移。

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