食管鱗癌患者血漿lncRNA TUC338表達變化及其臨床意義

孫開顏，趙新煒，楊麗君，董翠翠，董樹嶺，尹惠卿，明亮，賀付成

(1 鄭州大學第一附屬醫院，鄭州450052；2 天津兒童醫院)

食管癌的主要組織學類型為鱗癌和腺癌，其中90%以上為鱗癌[1]。據統計，食管鱗癌(ESCC)早期診治者5年生存率可超過90%[2～4]。但目前臨床上缺少早期診斷敏感、特異的無創性診斷技術或指標。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種沒有編碼功能、長度大于200 nt的功能性RNA分子，其不編碼蛋白質，而是以RNA的形式在表觀遺傳調控、基因轉錄調節、轉錄后加工等方面調控基因表達[5]。在體內，lncRNA可參與多種生物學過程的調控，在細胞分化、胚胎與組織發育等多種生命活動中發揮重要作用[6～8]。近年研究發現，腫瘤患者血漿lncRNA水平特異性變化與病情進展有關，可能作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發生、發展[9～11]。推測lncRNA有可能成為一種ESCC早期診斷的非侵入性腫瘤生物標志物。本研究觀察了ESCC患者血漿lncRNA TUC338表達變化，并分析lncRNA TUC338早期診斷ESCC的潛在價值，旨在為尋找新的腫瘤生物標志物提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年7月～2017年1月鄭州大學第一附屬醫院收治的ESCC患者116例(ESCC組)。所有患者經消化內鏡活檢或術后組織病理檢查明確診斷，術前未接受任何抗腫瘤治療。排除伴發器質性或系統性疾病，如糖尿病、高血壓等，以及合并其他腫瘤者。其中，男56例、女60例，年齡45～84(65.76±7.83)歲；腫瘤直徑：≤3 cm 54例，>3 cm 62例；腫瘤部位：胸上段41例，胸中段39例，胸下段36例；組織分化程度：高中分化65例，低未分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期63例；有淋巴結轉移59例，無淋巴結轉移57例。同期另選在本院體檢的健康者39例(對照組)，男21例、女18例，年齡44～85(65.62±7.24)歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 血漿和食管組織lncRNA TUC338表達檢測 ①樣本收集與處理：ESCC組于術前、對照組于體檢日采集空腹靜脈血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，靜置20 min，3 000 r/min離心10 min，小心將上層血漿轉移至新的EP管中，12 000 r/min離心10 min，將上層血漿再次轉移至新的EP管中，-80 ℃保存備用。另選ESCC組織及其配對的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，置于RNA保存液中，-80 ℃保存備用。②血漿和食管組織總RNA提取：取上述血漿250 μL，加入TRIzol LS 750 μL，充分混勻，按照TRIzol LS試劑盒說明提取總RNA；取癌組織及其配對的癌旁正常組織各30 mg，液氮下研磨成粉末，然后加入TRIzol 1 mL，充分混勻，按照TRIzol試劑盒說明提取總RNA。經NanoDrop 2000C紫外分光光度計檢測，OD260/OD280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格，調整總RNA濃度至300 ng/μL進行后續實驗。③逆轉錄反應：將總RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明逆轉錄為cDNA，所得cDNA -20 ℃保存。④實時熒光定量PCR：lncRNA TUC338及其內參GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設計合成。引物序列：lncRNA TUC338上游引物5′-TCCACAGGACAGGTACAGCA-3′，下游引物5′-GCCTTGGAGACTGAACATCC-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。取cDNA 2 μL，按SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明進行PCR擴增。PCR反應體系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.4 μL；反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s、58 ℃退火34 s共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA TUC338相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 相關性分析 隨機選擇46例ESCC患者，采用Spearman秩相關分析法分析血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達的關系。分析血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數的關系。

1.4 血漿lncRNA TUC338表達對ESCC的診斷效能分析 繪制血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的受試者工作特征(ROC)曲線，計算曲線下面積。以cut off值為截斷值，計算血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的敏感性及特異性。

2 結果

2.1 兩組血漿lncRNA TUC338表達比較 ESCC組及對照組血漿lncRNA TUC338相對表達量分別為2.60±0.83、1.03±0.32，二者比較P<0.01。

2.2 ESCC組織及癌旁正常組織lncRNA TUC338表達比較 ESCC組織及癌旁正常組織lncRNA TUC338相對表達量分別為2.47±0.69、1.02±0.29，二者比較P<0.01。

2.3 ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達的關系 Spearman秩相關分析顯示，ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達呈正相關關系(r=0.643，P<0.01)。

2.4 血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數的關系 見表1。

表1 血漿lncRNA TUC338表達與ESCC患者臨床病理參數的關系

2.5 血漿lncRNA TUC338表達對ESCC的診斷效能 ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA TUC338表達診斷ESCC的曲線下面積為0.684(95%CI： 0.567～0.780，P<0.01)，其cut off值為1.415，此時其診斷ESCC的敏感性為63.4%、特異性為78.1%。

3 討論

研究發現，lncRNA在血液中穩定性較高，可通過包被在外泌體、微泡等微粒中免于被核糖核酸酶降解，而且在室溫下放置24 h以上甚至反復凍融亦相當穩定[12]。與miRNA一樣，lncRNA亦能存在于腫瘤患者尿液、唾液和血液中[13]，如lncRNA HOTTIP-005在胰腺癌患者血漿中異常表達，可作為胰腺癌診斷和患者預后判斷的潛在生物標志物[14]；lncRNA-HEIH在肝細胞癌患者血漿中高表達，其表達變化與肝細胞癌病情進展有關，可用于肝癌的早期診斷以及患者預后監測[15]。因此，血漿中某些核酸分子水平變化有助于腫瘤的診斷[16]。但血漿lncRNA能否作為ESCC早期診斷的生物標志物尚不十分清楚。

人TUC338序列全長590 bp，基因位于12號染色體。多聚胞嘧啶結合蛋白2基因獨立轉錄形成UC338轉錄片段，TUC338為克隆該轉錄片段而來。Braconi等[17]研究發現，TUC338在人肝細胞癌中表達顯著增加，沉默TUC338表達可抑制肝癌細胞生長。牟麗莎等[18]研究發現，應用RNAi技術下調TUC338表達可使膀胱癌細胞凋亡增加，推測TUC338可作為膀胱癌藥物治療潛在的作用靶點。Ouyang等[19]研究發現，抑制TUC338表達后，CAL-27和SCC-9兩種舌鱗癌細胞增殖均受到抑制，細胞凋亡增加，說明TUC338可參與舌鱗癌的發生、發展。本研究結果顯示，ESCC組血漿lncRNA TUC338相對表達量明顯高于對照組；ESCC組織lncRNA TUC338相對表達量明顯高于癌旁正常組織。提示lncRNA TUC338可能在ESCC發生、發展過程中具有癌基因作用。

本研究還發現，ESCC患者血漿與腫瘤組織lncRNA TUC338表達呈正相關關系，說明血漿lncRNA TUC338表達可反映腫瘤組織lncRNA TUC338表達。進一步研究發現，血漿lncRNA TUC338表達與ESCC組織TNM分期有關。腫瘤惡性程度越高，血漿lncRNA TUC338表達越高，提示血漿lncRNA TUC338可能參與ESCC的惡性轉化。本研究ESCC有淋巴結轉移者血漿lncRNA TUC338表達高于無淋巴結轉移者，提示血漿lncRNA TUC338可能參與ESCC的侵襲和轉移。本研究ROC曲線分析顯示，血漿lncRNA TUC338診斷ESCC的敏感性為63.4%、特異性為78.1%，提示血漿lncRNA TUC338有可能作為診斷ESCC的潛在生物標志物。但由于本研究樣本量較少，其結論還有待于進一步研究證實。

綜上所述，ESCC患者血漿LncRNA TUC338高表達，其表達變化與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移有關；血漿LncRNA TUC338有可能作為診斷ESCC的潛在生物標志物。

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